WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

КОНСТАНТИНОВА

НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ВЛИЯНИЕ КЛИНОСТАТИРОВАНИЯ НА НАЧАЛЬНЫЕ СТАДИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ IN VITRO

14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) и Институте молекулярной генетики Российской академии наук (ИМГ РАН)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна,

доктор биологических наук, профессор Гривенников Игорь Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Гаврилюк Борис Карпович

доктор медицинских наук, профессор Ильин Евгений Александрович

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Защита состоится «_____»_______________2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) по адресу:

123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76-а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН

Автореферат разослан «_____»_______________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М.А. Левинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Эволюционные процессы на Земле осуществляются при постоянном участии гравитационного поля. Гравитация определяет нормальное развитие, морфологию и функционирование всех живых организмов в мире. В течение длительного периода эволюции жизни на планете все организмы приспосабливались к гравитационным условиям, начиная от становления структуры и функции отдельных органов, тканей и кончая целым организмом.

Исследования влияния факторов космического полета, в том числе микрогравитации, на процессы развития, дифференцировки и регенерации живых организмов, проводившиеся с начала освоения космического пространства [Мелехова О.П. и др., 1976; Сушков Ф.В. и др., 1979; Оганесян С.С. и др., 1980; Мелешко Г.И., 1991; Гурьева Т.С. и др., 1993; Mitashov V.I. et al., 1996; Black S.B. et al., 1996; De Mazire A. et al, 1996; Grigoryan E., et al, 2006], не потеряли свою актуальность до настоящего времени, поскольку до сих пор не установлен вклад гравитационного фактора в механизмы становления живых систем.

Использование различных биологических моделей позволило выяснить ряд важных закономерностей, в том числе возможность нормального развития биообъектов при создании адекватных условий их существования в космическом полете [Сычев В.Н., 2000; Серова Л.В., 2002; Mitashov V.I. et al., 1996; Almeida E.A.C. et al, 2006; Grigoryan E., et al, 2006]. Однако исследования в космическом полете и при моделировании некоторых эффектов микрогравитации на Земле свидетельствуют о том, что нет живых систем, развитие которых бы не менялось в этих условиях. Однако изменения на клеточном уровне, происходящие в условиях как реальной, так и моделированной микрогравитации, не позволяют в настоящее время сформулировать общие закономерности этого воздействия. Поэтому вопрос о влиянии гравитации на клетку и механизмах развивающихся эффектов весьма актуален. Существует мнение, что чувствительность к изменению силы тяжести зависит от размеров биообъекта: чем он меньше, тем меньшее влияние гравитации стоит ожидать. Утверждается также, что на живые организмы оказывает влияние не сила тяжести, а среда, в которой находится организм, поэтому зачастую изменение силы тяжести существенно не влияет на рост и морфологию клеток в культуре [Парфенов Г.П., 1988], однако встречаются и обратимые клеточные реакции на гравитационное возмущение.

Ранее было показано, что микрогравитация меняет морфо-функциональное состояние клеток in vitro, их пролиферативную активность, экспрессию генов и другие внутриклеточные процессы. Особенно выражены эти эффекты у механочувствительных дифференцированных клеток, таких как остеоциты, фибробласты, миоциты, эндотелиальные клетки [Таирбеков М.Г., 1997; 2000; Романов Ю.А., Буравкова Л.Б. и др., 2000, 2001;. Crawford-Young S.J., 2006]. В последнее время получены результаты, свидетельствующие о влиянии клиностатирования на мезенхимальные клетки-предшественники, выделенные из костного мозга человека, и предшественники остеобластов [Buravkova L.B. et al, 2004; Facer S. R, 2005; Meyers V.E. et al, 2004].

Вопрос о том, может ли гравитационный фактор влиять на клетки находящиеся на самых ранних этапах развития и дифференцировки, а именно на эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) млекопитающих, остается открытым. Эти клетки характеризуются несколькими весьма важными свойствами: неограниченной способностью к пролиферации при сохранении нормального кариотипа и возможностью дифференцироваться во все известные виды клеток организма [Evans M.J., 1981; Guan K. et al., 1998; Keller G., 2005]. Поэтому ЭСК и сформированные ими эмбриоидные тела (ЭТ) служат адекватной моделью для изучения механизмов, регулирующих начальные стадии как спонтанной, так и индуцированной различными воздействиями дифференцировки клеток.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование эффектов клиностатирования на начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток in vitro.

Задачи исследований.

  1. Отработать экспериментальную модель для клиностатирования культивируемых ЭСК мыши на различных субстратах.
  2. Оценить динамику образования колоний ЭСК мыши при клиностатировании.
  3. Исследовать жизнеспособность ЭСК мыши и их способность образовывать ЭТ после моделирования эффектов гипогравитации.
  4. Изучить морфологические изменения ЭСК на начальной стадии дифференцировки (стадия ЭТ) при воздействии клиностатирования.
  5. Оценить способность ЭСК к последующей спонтанной дифференцировке после воздействия клиностатирования.

Научная новизна. Впервые установлено, что in vitro ЭСК мыши могут сохранять свои морфо-функциональные свойства в условиях моделирования гравитационных изменений. Показано, что чувствительность ЭСК к клиностатированию возрастает в зависимости от стадий развития клеток: от колоний ЭСК до сформированных ЭТ. Впервые показано, что клиностатирование ЭТ приводит как к запаздыванию начала кардиомиоцитарной дифференцировки, так и к существенному уменьшению количества сокращающихся кардиомиоцитов. Продемонстрировано, что рандомизация вектора гравитации приводит к стимулированию образования клеток ранних стадий нейрональной дифференцировки и незначительному снижению их количества на поздних стадиях.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание процессов роста и дифференцировки ЭСК в условиях моделирования эффектов гипогравитации. Создана и успешно апробирована экспериментальная модель, включающая как ЭСК, так и эмбриоидные тела, позволяющая исследовать влияние клиностатирования на начальные этапы эмбрионального развития млекопитающих in vitro.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Оценка двух способов культивирования ЭСК мыши линии R1 в условиях клиностатирования выявила большую эффективность использования в качестве подложки эмбриональных фибробластов мыши, позволяющей осуществлять длительное моделирование эффектов гипогравитации.
  2. Моделирование эффектов гипогравитации не выявило изменений колониеобразования, при сохранении последующей жизнеспособности и нормального образования ЭТ недифференцированными ЭСК мыши линии R1.
  3. Клиностатирование эмбриоидных тел in vitro приводит к замедлению спонтанной дифференцировки в кардиомиоциты, при этом происходило существенное увеличение количества -III тубулин - положительных клеток и незначительное уменьшение количества MAP2-положительных клеток.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005); Конференциях молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005, 2006, 2007 гг.); XIII Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2006 г.); 27-м, 28-м Международных симпозиумах по гравитационной физиологии (Осака, Япония, 2006 г; Сан-Антонио, Техас, США, 2007 г.); Школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (С-Петербург, 2008 г.).

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая биология и физиология» (протокол № 5 от 03.06.08 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, выводов, заключения, списка литературы. В диссертации приведены 8 таблиц и 38 рисунков. Список использованной литературы содержит 63 отечественных и 116 зарубежных источника.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследований

Клиностатирование культивируемых ЭСК мыши. Известно, что с помощью горизонтального клиностата можно моделировать некоторые клеточные эффекты микрогравитации [Moore D., 1996; Jack J.W.A. van Loon, 2007; 2007a]. ЭСК на подложке из инактивированных митомицином С (5 мкл/мл) эмбриональных фибробластов подвергали действию клиностатирования (6 об/мин, 72 ч). Для постоянного перемешивания среды культивирования использовали горизонтальный шейкер (60 об/мин) – динамический контроль. Культивирование ЭСК (15-33 пассажи, 150-200 тыс. клеток) осуществляли в СО2-инкубаторе («Sanyo», Япония) при температуре 37° С и 5 % СО2 на флаконах 25 см2 в среде -МЕМ («ICN», США), содержащей 15 % охарактеризованной фетальной сыворотки коровы (FBS) («Hyclon», США) и все необходимые добавки.

Методика клиностатирования колоний ЭСК с добавлением фактора, ингибирующего лейкемию (LIF) была аналогична, но клетки помещались в условия клиностатирования спустя 24 ч после посева на флаконы (80 тыс. клеток на желатиновой подложке), экспозиция - 48 ч.

Анализ изображения. Для анализа образования колоний ЭСК в ходе клиностатирования (72 ч) осуществляли фотосъемку (каждые 24 ч) стационарных полей наблюдения (по 6 в каждом флаконе) на инвертированном микроскопе («Zeiss», Axiovert 25, Германия) с увеличением объектива х10 при помощи цифровой фотокамеры («Mintron», Тайвань). Количественный анализ сфотографированных колоний, а также их морфометрия (площадь, периметр, максимальный и минимальный диаметр) были проведены с помощью компьютерной программы SigmaScan Pro5 («Sigma», США).

Оценка жизнеспособности. Для оценки жизнеспособности и способности образовывать ЭТ клетки после клиностатирования высевали на чашки Петри (диаметр 35 мм, 80 тысяч клеток) в среде -МЕМ с фактором, ингибирующем лейкемию (LIF) (20 мкл/мл) для последующего образования колоний и по 200 тысяч клеток в той же среде, но без добавления LIF - на чашки для определения количества образующихся ЭТ. Спустя 3-4 сутки после посева клеток производили подсчет колоний (7 произвольных полей зрения (х100) и образовавшихся ЭТ (суспензия 5 мкл, 5 полей).

Клиностатирование ЭТ. ЭТ культивировали в условиях клиностатирования (72 ч), пассируя 600 тел в культуральных флаконах 25 см2, в среде -МЕМ («ICN», США), содержащей все необходимые добавки. Условия клиностатирования ЭТ не отличались от условий, которые были описаны для культивирования ЭСК на стадии колоний.

Дифференцировка ЭСК. Исследование последующей дифференцировки клеток in vitro в кардиомиоциты проводили после 72 ч клиностатирования ЭТ методом регистрации появления сокращающихся кластеров. Подсчет образованных сокращающихся кластеров осуществляли каждые 24 ч при помощи микроскопа и цифровой видео камеры; делая видеозапись сокращений.

Исследование влияния клиностатирования на последующую нейрональную дифференцировку клеток in vitro производили следующим образом. ЭСК линии R1 (21-25 пассажи) в количестве 100-200 тыс. клеток пассировали на флакон (9,1 см2). Образованные ЭТ подвергались клиностатированию (48 ч) и впоследствии с каждого флакона (опыт, статический и динамический контроли) высевали на 4-х луночные планшеты (8 ЭТ на каждую лунку). Спустя 18 дней проводили иммуноцитохимическое окрашивание антителами против соответствующих нейрональных антигенов.

Анализ морфологии ЭТ. Влияние клиностатирования на морфологию ЭТ проводили с использованием полутонких срезов (толщина 1-2 мкм) ЭТ. Исследование срезов ЭТ было выполнено в Институте морфологии человека РАН совместно с к.м.н. Черниковым В.П. и на Факультете фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова совместно с д.м.н. Буравковым С.В. ЭТ фиксировали глутаровым альдегидом (2,5 %), осуществляли последовательные операции центрифугирования и обезвоживания для получения клеточного осадка, из которого впоследствии при помощи ультрамикротома («Nova», LKB, Швеция) готовили полутонкие срезы. Полученные образцы помещались на предметное стекло и окрашивались метиленовым синим с азуром 2 + фуксином. Затем фотографии полутонких срезов анализировали и подсчитывали количество апоптотических клеток и площади образованных полостей.

Статистическая обработка результатов. Обработку результатов колониеобразования, образования сокращающихся кластеров кардиомиоцитов и нейронов, а также подсчет апоптотических клеток и полостей внутри ЭТ проводили на основе стандартного пакета статистических программ «Statistica 7.0» для WinXP с использованием непараметрических методов распределения сравнения данных (критерий Крускола-Уолисса и Данна), сравнение двух независимых между собой групп (критерий Манна-Уитни) и метода оценки достоверности сдвига в значениях исследуемого признака (критерий Фридмана).

Результаты и обсуждение

Влияние клиностатирования на образование колоний и морфологию эмбриональных стволовых клеток мыши линии R1, культивируемых на подложке из эмбриональных фибробластов мыши

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»