WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Для получения разрешения на проведение клинических испытаний и официаль-ного внедрения в клиническую практику химиотерапевтических режимов, с включением не имеющего утвержденных показаний к применению препарата, требуется проведение комплексных доклинических исследований, включающих изучение его токсических свойств в новых режимах, изучение специфической активности препарата как на лабораторных, так и на клинических штаммах in vitro и in vivo, с обязательным подбором терапевтических доз.

Объем доклинических испытаний определялся нормативными документами: «Правила лабораторной практики в российской Федерации» (Приказ МЗ РФ от 19.06.2003 г. N 267); «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ».– М.– ОАО «Издательство «Медицина».– 2005. –С.41-53.

В исследованиях использован препарат Спарфло® (производитель – «Dr. Reddy`s Laboratories Ltd.»), в форме таблеток, покрытых пленочной оболочкой, содержащий 200 мг спарфлоксацина, регистрационный номер П№011913/01-2000, и субстан-ция спарфлоксацина серии SF023A06. Срок годности препарата и субстанции – в течение всего эксперимента.

Изучение общетоксического действия

Целью исследования являлось установление характера и выраженности повреж-дающего действия спарфлоксацина на организм экспериментальных животных при его однократном и многократном введении.

Изучение острой токсичности

Острая токсичность спарфлоксацина изучена при однократном введении на жи-

вотных обоего пола: мышах (Swiss, n=6 пол/группа; m=18-20г) и крысах (Wistar, n=6 пол/группа, m=160-180г). При внутрибрюшинном введении изучены дозы для мышей 75, 775, 1550, 3100 мг/кг (объём введения 0,5 мл/100 г массы тела), для крыс – 85, 850, 1400 мг/кг (объём введения 0,2 мл/100 г массы тела), в расчете на активный компонент. При внутрижелудочном введении зондом изучены дозы для мышей 75, 2875, 5750, 11500 мг/кг (объём введения 0,5 мл/100 г массы тела), для крыс – 85, 2170, 4340 мг/кг (объём введения 0,2 мл/100 г массы тела), в расчете на активный компонент. В качестве контроля при внутрибрюшинном пути использован 0,9% раствор натрия хлорида, а при внутрижелудочном – 1% водная суспензия крахмала. Срок непрерывного наблюдения – 15 суток.

Изучение хронической токсичности

Вследствие отсутствия различий в половой чувствительности исследование проводилось на 75-ти самцах белых аутбредных крыс Wistar с массой тела 160-180 г., разделенных на четыре группы. Препарат вводился животным внутрижелудочно зондом в 1% водной суспензии крахмала в объеме 0,2 мл/100 г массы тела животного один раз в день, в дозах 57, 285, 570 мг/кг, а контрольной группе – только суспензия. Выбранные дозы соответствовали максимальной суточной дозе, а также пяти и десятикратному её значению для вида животного.

В каждой группе на 60-й, 120-й и 180-й день введения, для оценки токсического воздействия тестируемого вещества, проводилась эвтаназия пяти животных. После окончания введения (180 сут) за оставшимися животными наблюдали в течение 30 суток, после чего их эвтаназировали (на 210-й день).

Использовали физиологические, гематологические, биохимические и морфо-логические методы исследования. Анализ функционального состояния органов и систем, по рекомендованным методикам, проводили до введения препарата, на 30-й, 60-й, 120-й и 180-й дни от начала введения и спустя 30 дней (210-й день) после отмены препарата. Проводилась оценка общего состояния, спонтанной двигатель-ной активности животных. Контроль за сердечной деятельностью осуществляли по электрокардиограмме (ЭКГ) у пяти животных отобранных случайным образом из групп получавших контрольное вещество и максимальную дозу спарфлоксаци-на. Патоморфологические исследования проводились распределенно по группам на 30-й, 60-й, 120-й, 180-й и 210-й дни.

Эффективность спарфлоксацина при лекарственно-устойчивом туберкулё-зе в эксперименте

Изучение эффективности спарфлоксацина, в комбинации с основными ПТП, оценивалась in vivo, на модели генерализованного туберкулёзного процесса у самцов белых аутбредных (Swiss) или BALB/c мышей (выбор конкретного вида животных приводится в описании соответствующего эксперимента) на высоко-чувствительном к ПТП лабораторном штамме МБТ H37Rv или устойчивом диком N128, выделенном от больного туберкулезом, не получавшем ранее лечение фтор-хинолонами. Дикий штамм МБТ проявлял устойчивость к рифампицину (25 мкг/ мл), изониазиду (1 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл) и канамицину (50 мкг/мл).

При эксперименте на модели генерализованного туберкулезного воспаления у мышей культивирование бактериального материала и его введение животным, а также последующая подготовка и культуральное исследование тканей селезенки проводилось по единым стандартизованным методикам для всех экспериментов.

Колонии МБТ (соответствующего исследованию штамма) культивировались в

бульоне Дюбо 7 дней при температуре 37°C. Суспензия культуры разводилась бульоном для достижения показателя 100 клеток/мл (колориметрически), что сос-тавляло, приблизительно, 5х107 КОЕ/мл. Количество прививочного материала определялось титрованием и расчетом из трех чашек со средой.

Модель генерализованного туберкулёза воспроизводили инокуляцией животным внутривенно 0,5 мл суспензии МБТ, содержащей 105 КОЕ соответствующего штамма. Через 14 дней после инокуляции, перед началом введения препаратов, для проверки развития генерализованного туберкулезного процесса, 10 животных эвтаназировалось, остальные – распределялись по группам.

Препараты вводились внутрижелудочно зондом, в составе 1% водной суспензии крахмала, ежедневно, один раз в день, в одно и то же время суток (в утренние часы), на протяжении 30 дней. Дозы рассчитывались на основе последних данных среднего выборочного значения массы тела. Расчет дозы для введения животным проводился на основе сходства площадей под фармакокинетической кривой (AUC0-) между данным видом экспериментальных животных и значениями у человека, при отклонениях в параметрах не более 5%.

Осмотр животных проводился ежедневно. На 30-й день животные эвтаназирова-лись и изучались патоморфологическими методами. В асептических условиях за-бирался материал для гистологии и микробиологических исследований. Селезенку каждой участвующей в исследовании особи гомогенизировали, доводили объем гомогената до 5 мл 0,05% раствором PBS/Tween 80, полученную суспензию высе-вали на среду «Middlebrook 7H10 агар», с добавлением 10% обогащенной пита-тельной среды OADC (масляная ацид-альбумин-декстроз-каталаза; Difco Laborato-ries, США), 0,05% раствора Tween 80 и 5% глицерола, pH 6,6. Посевы инкуби-ровали в роторном шейкере при температуре 370С в течение 6 недель, после чего подсчитывали число КОЕ.

В исследовании принято, что 1-м днем является день начала введения тести-руемых препаратов и контрольного вещества, после развития у эксперименталь-ных животных генерализованного туберкулезного воспаления.

Активность спарфлоксацина в отношении МБТ (чувствительных и устой-чивых к основным ПТП) in vitro, в сравнении с ломефлоксацином

Критерии оценки – уровни минимальной подавляющей и бактерицидной концентрации (МПК, МБК), определяемые стандартным методом серийных разве-дений, в соответствии с требованиями Фармакологического комитета РФ.

Тест-культуры: 1) H37Rv – лабораторный штамм М.tuberculosis, высоковирулент-ный, чувствительный к основным ПТП. 2) Культуры М.tuberculosis, выделенные из мокроты больных (4 штамма: 128, 117, 116, 70) с различной устойчивостью к основным ПТП. Для опытов использовали стандартизованные субстанции спар-флоксацина и ломефлоксацина.

Для определения МПК и МБК в течение 2 недель тест-культуры выращивали в жидкой питательной среде Школьниковой, с добавлением различных концентра-ций спарфлоксацина или ломефлоксацина (8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,063 мкг/мл).

Через 2 недели готовили мазки (окраска по Цилю-Нильсену), в которых, подсчи-тывали число МБТ и определяли МПК препарата, а также проводился посев культуры на твердую питательную среду Lwenstein-Jensen, в которой оценивалась жизнеспособность МБТ после воздействия препарата. Полное отсутствие роста культуры оценивали как МБК препарата.

Сравнительная эффективность различных доз спарфлоксацина в лечении генерализованного туберкулезного воспаления у мышей, вызванного лекарственно-устойчивыми МБТ, в сравнении с ломефлоксацином

Эффективность действия различных доз спарфлоксацина, в сравнении со стан-дартной дозой ломефлоксацина, оценивалась на модели генерализованного тубер-кулёза у самцов белых аутбредных мышей Swiss (n=70), вызванного штаммом МБТ N128, распределено по группам: спарфлоксацин (6,3; 12,5; 25; 50; 100 мг/кг), ломефлоксацин (400 мг/кг) и контроль (1% водная суспензия крахмала).

Эффективность химиотерапии оценивали по степени пораженности генерали-зованным туберкулезным процессом легких (гистологическая характеристика про-цесса, объемная плотность очагов поражения) и селезенки (гистологическая харак-теристика процесса, число эпителиоидноклеточных гранулем), высеваемости МБТ из гомогената селезенки. Число эпителиоидноклеточных гранулем в селезенке и объемную плотность очагов туберкулезной пневмонии подсчитывали в гистоло-гических препаратах окрашенных гематоксилином и эозином.

Эффективность противомикробного действия различных доз спарфлоксацина, в сравнении с ломефлоксацином, в отношении устойчивого штамма МБТ, оцени-вали спустя 30 дней по показателям среднего выборочного значения числа КОЕ в селезенке, подготовленной по вышеописанной методике.

Эффективность лечения ПТП модели генерализованного туберкулезного воспаления у мышей, вызванного лекарственно-устойчивыми МБТ

Изучение лечебного эффекта спарфлоксацина проводили в сравнении с други-ми ПТП на модели генерализованного туберкулеза у мышей чувствительной к туберкулезной инфекции линии BALB/c (n=220), их инфицированием диким штаммом N128 МБТ. Животные были распределены по группам (контроль – 1% водная суспензия крахмала; ломефлоксацин 400 мг/кг; офлоксацин 300 мг/кг; рифампицин 10 мг/кг; изониазид 25 мг/кг; спарфлоксацин 50 мг/кг; спарфлок-сацин 100 мг/кг), по 30 в каждой. По 10 животных в каждой группе эвтанази-ровались на 14, 28 и 56 дни от начала введения тестируемых препаратов. Влияние препаратов на степень выраженности одного из сопутствующих туберкулезному процессу симптомов – спленомегалии, оценивалось по разнице средней выбороч-ной массы селезенки в исследуемых группах. Эффективность противомикробного действия, в отношении исследуемого штамма МБТ N128, определялась путем подсчета числа жизнеспособных МБТ в селезенке, подготовленной по описанной выше методике.

Эффективность противотуберкулезного действия спарфлоксацина в комби-нации с основными противотуберкулезными препаратами

Оценка эффективности проводилась на модели генерализованного туберкулёз-ного процесса у самцов белых аутбредных мышей Swiss на двух штаммах МБТ H37Rv и N128, распределено по группам: 1% водная суспензия крахмала (контроль); изониазид (25 мг/кг); рифампицин (25 мг/кг); спарфлоксацин (50 мг/кг); изониазид (25 мг/кг) и спарфлоксацин (50 мг/кг); рифампицин (25 мг/кг) и спарфлоксацин (50 мг/кг); изониазид (25 мг/кг) и рифампицин (25 мг/кг); изониазид (25 мг/кг) с рифампицином (25 мг/кг) и спарфлоксацином (50 мг/кг). В исследовании с каждым из штаммов МБТ участвовало по 55 мышей.

Эффективность противомикробного действия спарфлоксацина в комбинации с другими ПТП, в отношении устойчивых и чувствительных к ПТП штаммов МБТ, оценивали спустя 30 дней по среднему выборочному значению числа КОЕ в селезенке, подготовленной по описанной выше методике.

2. Клинические исследования

В доклинических исследованиях установлена эффективность спарфлоксацина в комбинированных противотуберкулезных схемах терапии. В сравнительных доклинических исследованиях с единственным зарегистрированным в РФ для лечения туберкулеза лёгких (в период проведения исследования) фторхинолоном ломефлоксацином, спарфлоксацин продемонстрировал значимое преимущество как в исследованиях in vivo, так и in vitro. Кроме того, по имеющимся данным немногочисленных зарубежных ограниченных клинических исследований, спарфлоксацин показал значимо более высокую эффективность по сравнению с такими фторхинолонами как ломефлоксацин, офлоксацин, гатифлоксацин и сравнимую с левофлоксацином и моксифлоксацином, при лучшем профиле безопасности [Shandil R. et al., 2007]. Исходя из этого и основываясь на рекомендациях этического комитета при Росздравнадзоре, дизайн клинического исследования был выбран как проспективное, открытое, несравнительное, нерандомизированное. Клиническое испытание выполнялось в условиях стационара НИИ Фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова (Разрешение на проведение клинических исследований от 06.04.2006 г. № 109 Росздравнадзора Минздравсоцразвития РФ), в соответствие с правилами качественной клинической практики (GLP).

Целью клинического исследования являлось определение эффективности и безопасности противотуберкулезной химиотерапии с включением в клинические терапевтические схемы спарфлоксацина, при лечении больных туберкулезом легких с сохраненной чувствительностью, но установленной непереносимостью первой линии противотуберкулезной терапии, или неэффективностью предшествующей терапии, в связи с множественной лекарственной устойчивостью микобактерии туберкулеза. На основании клинических, лабораторных, рентгенологических и бактериологических данных, сообщениях о нежелательных явлениях проводилась оценка безопасности и переносимости комплексной терапии лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких, с включением в клинические терапевтические схемы спарфлоксацина.

В исследование эффективности и безопасности включены больные обоего по-ла, в возрасте 18–50 лет, имеющие различные формы впервые выявленного тубер-кулеза легких, ранее не получавшие фторхинолоны, имеющие адекватную функ-цию внутренних органов, отсутствие гиперчувствительности к фторхинолонам, беременности или кормления грудью.

Критериями исключения являлись: гиперчувствительность к фторхинолонам; заболевания центральной нервной системы (эпилепсия, склонность к судорожным припадкам), алкоголизм, наркомания; заболеваниями желудочно-кишечного трак-та и печени в острой фазе; гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца

в период обострения; тяжелая почечная недостаточность; беременность; лактация.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»