WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 10 |

Популяция CD4+CD25+ Т-клеток человекагетерогенна по функциональным свойствам ифенотипическим признакам. Она включает всебя популяции пролиферирующих CD4+CD45RA+CD45R0+CD25low Т-клеток и«регуляторных» (T-reg– T regulatory) CD4+CD45R0+CD25high Т-лимфоцитов.Идентификацию этих популяций клеток принятопроводить по совокупности количественныхпараметров экспрессии молекул CD38, CD62L, CD95 и HLA-DR. Вподобном случае правильный выбор областей анализа(Рис. 26 и 28) в наибольшей степени определяеткорректность описания субпопуляцийCD4+CD25+ Т-лимфоцитовчеловека. Согласно проведенному анализу,фенотипические признаки субпопуляцииCD25high,CD25low иCD25–Т-лимфоцитов полностью отвечаютсуществующим критериям для данных типовТ-клеток (Jonuleit H.,et al., 2001; Baecher-Allan C., et al., 2001; Shevach E.M., 2002).

Рис. 27. Многоэтапноегейтирование при анализе T-reg клеток впериферической крови. А – гистограммараспределения CD127 и CD25 после одновременногогейтирования по CD4 и CD45. В зоне Е находятсярегуляторные клетки. Б - гистограммараспределения CD4 и CD25 после гейтированиятолько по CD45. Черные точки – T-reg клетки.

T-reg клетки имеютследующий фенотип CD3+CD4+CD25highCD45R0+CD95+,однако наиболее важным их маркером является FOXP3. Исследования показали, чтоFOXP3, который кодирует фактор транскрипциискурфин (scurfin), является главным регулирующимгеном для развития и функционированияCD4+CD25high регуляторных T клеток. Такимобразом, самым точным маркером дляидентификации T-regклеток является как раз фактортранскрипции FOXP3. Однако он являетсявнутриклеточным маркером, чтозначительно затрудняет работу поидентификации T-reg(Schubert L.A., et al., 2001).

Исследованияпоследних лет показали, что экспрессия CD127на T-reg клетках снижена илиотсутствует. В свою очередь, эксперементыin vitro выявили, чтоэкспрессияCD127 после активации Т клеток резкоснижается. CD127 представляет из себя -цепьгетеродимерного рецептора IL-7, которыйсостоит из CD127 и общей -цепи, котораяпредставлена и у других рецепторовцитокинов (IL-2R,IL-4R, IL-9R, IL-15R, и IL-21R). CD127 экспрессируется натимоцитах, T-и B-предшествинниках, зрелых T клетках,моноцитах, и некоторых других лимфоидных и миелоидныхклетках. Показано, что IL-7R играет важную рольв пролиферации и дифференцировке зрелых Tклеток (RyanD.H., et al., 1997; Zaunders J.J., et al., 2006).

Таким образом,окончательный фенотип T-reg клеток будетвыглядеть следующим образом: CD3+CD4+CD25brightCD127dim-to-negFOXP3+и для их детектирования можно использовать данныйфенотип T-reg,без выявления FOXP3. Для более точнойлокализации T-regклеток предпочтительно использоватьмногоцветный анализ и многоэтапноегейтирование с использованием следующегонабора МА –CD45-FITC, CD4-PC7, CD25-PC5 и CD127-PE (Рис. 27).Среднестатистические результаты анализаT-reg клеток взрослыхусловно здоровых лиц представлены вТаблице 5.

Таблица 5. Среднестатистическое содержаниесубпопуляций регуляторныхТ-клеток в периферическойкрови взрослых условно здоровых лиц(N = 60).

Субпопуляции

Содержание

Относительное (%)

Абсолютное количество (кл/л)

Общие Тхелперы

45 ±10

0,576-1,336x 109

Регуляторные Т-клетки (относительно Тхелперов)

3,7± 2,05

0,009-0,078 х109

Субпопуляции CD4+CD25+ Т-клеток проявляютнеодинаковую чувствительность к действиюиономицина. В иономицин резистентнойфракции(ИР-фракции) значительно возрастает доля CD4+CD25high Т-клеток посравнению с кровью того же донора, асодержание CD4+CD25lowТ-лимфоцитов – уменьшается. Следовательно,большинство CD4+CD25highТ-лимфоцитов представлено резистентными кдействию иономицина клетками. Полногоисчезновения CD4+CD25lowТ-лимфоцитов в ИР-фракции никогда ненаблюдалось. Следовательно, и в составеCD4+CD25low Т-лимфоцитовприсутствуют клетки, различающиеся посвоей чувствительности к действию иономицина.Изменение содержания субпопуляцийCD4+CD25+ Т-лимфоцитов вответ на действие иономицина напрямуюзависело от исходной доли Т-клеток с даннымфенотипом в крови. Однако обогащениеИР-фракции CD4+CD25highТ-клетками и одновременное с ним снижениедоли CD4+CD25lowТ-лимфоцитов наблюдалось наиболее часто.

В сравнении с CD4+CD25high Т-лимфоцитамиПКЧ, ИР-популяция (Рис. 28) всегда обогащенаклетками с высоким уровнем экспрессиимолекул HLA-DR и CD95. Одновременно ИР CD4+CD25high Т-лимфоцитыхарактеризуются меньшей долей CD62L+ клеток (Рис. 28) изаметным снижением уровня экспрессии этихмолекул. По сравнению с CD4+CD25low Т-клетками ПКЧ,ИР-фракция обогащена CD95+ клетками с высокимуровнем экспрессии этих молекул (Рис. 28).При этом в ИР-фракции CD4+CD25low Т-лимфоцитовнаблюдалосьвыраженное уменьшение доли CD62L+ клеток и снижениеуровня экспрессии этих молекул. Среди ИРCD4+CD25low Т-лимфоцитовуменьшение доли CD38+ клеток (Рис. 28) происходит за счетлимфоцитов снизким уровнем экспрессии этого маркера.

Появление молекул HLA-DRна CD4+Т-лимфоцитах считается признаком позднейстадии активации этих клеток. СуществованиеCD4+CD25+HLA-DR+ Т-клеток в ПКЧ непозволяет полностью разграничить данный этапактивации Т-лимфоцитов от предыдущего. БольшинствоCD4+HLA-DR+ Т-клеток ПКЧ имеют,как правило, фенотип CD4+CD45RA–CD45R0+.Скорее всего, на поздних стадиях активацииin vivo в ходенормального развития первичного иммунногоответа основная часть этих CD4+ Т-лимфоцитовчеловека качественно изменяет свойхарактеррегуляции внутриклеточного Ca2+ и приобретаетрезистентность к действию низких дозиономицина.

Рис. 28. Анализсубпопуляций CD4+ Т-лимфоцитов человека до (а) ипосле (б)инкубации клеток с иономицином,проведенный методом проточной цитофлуориметрии иразработанного алгоритма (см. Рис. 26). По осиординатприведены значения долей клеток в составесоответствующей субпопуляции.

Маркер наиболеепоздней стадии активации invivo Т-лимфоцитов человека– молекулыCD29 (VLA – Very Late Antigen) – частоиспользуется как дополнительный признакпокоящихся CD4+CD45RA–CD45R0+Т-клеток памяти. В составе ИР-фракции CD4+CD45R0+CD29+ Т-клетокзначительно больше, чем в исходнойпопуляциитого же донора (Рис. 29). Вместе с тем, назначительной доле (в среднем около половины)CD4+CD45RA–CD45R0+ Т-лимфоцитовИР-фракции этот антиген отсутствует. Никакихэкспериментальных данных в литературе овзаимосвязи молекул CD29 и CD45R0 до настоящеговремени не описано. Степень обогащения ИР-фракцииCD4+CD45R0+CD29+ Т-лимфоцитамизависит от исходной доли клеток с даннымфенотипом в составе лимфоцитов ПКЧ, но вовсех исследованных случаях молекулы CD29экспрессируются на меньшей доле ИРCD4+CD45RA–CD45R0+ Т-клеток. Какправило, CD4+CD45R0–CD29+Т-клетки в ощутимых количествах встречаются только вкрови больных хроническими инфекциями.Сопоставимые результаты были получены для лимфоцитовздоровых лиц. Вероятнее всего, на позднейстадии активации большая часть CD4+CD45R0+CD29+ Т-лимфоцитовсостоит из резистентных к действию иономицинаклеток, а, возможно, определенная частьCD4+CD45R0+CD29– Т-лимфоцитовявляется чувствительными к его действиюклетками.

Рис. 29 Анализ составаCD4+Т-лимфоцитов человека до (а) и после (б)инкубации клеток с иономицином. Гистограммыпоказывают экспрессию CD45R0, CD26 и CD29 молекулна поверхности CD4+ Т-клеток.

Появление CD4+CD26+ Т-лимфоцитов такжепринято считать признаком специфическойактивации Т-клеток, хотя до сих поростается неясным, на какой стадиидифференцировки появляется данный маркер.В норме, около четверти CD4+ Т-клеток ПКЧэкспрессируют молекулы CD26. В ИР-фракции доляCD4+CD26+ Т-лимфоцитоввсегдазначительно выше, чем в ПКЧ того же донора,и составляла, как правило, более половинысоответствующей популяции (Рис. 29). Такимобразом, значительная часть CD4+CD26+CD45RA–CD45R0+ Т-лимфоцитовчеловека является резистентной к действиюиономицина.

В целом возникновениерезистентности к действию низких дозиономицина иизменение гомеостаза ионов кальция вCD4+ Т-клеткахнаиболеехарактерно для самых поздних стадийдифференцировки активированных in vivo CD4+ Т-лимфоцитовчеловека. В полной мере это свойствохарактерно для долгоживущих покоящихсяCD4+CD45RA–CD45R0+ Т-лимфоцитовпамяти человека.

Как и следует ожидатьот системы, работающей по принципуклональной селекции, каждый антиген активируетлишь ничтожно малую часть всей популяции Т-лимфоцитов.Для выполнения своих функций наивнымТ-лимфоцитам необходима пролиферация(поскольку на антиген реагируют лишьнемногие клоны, содержащие малое числоклеток, и для развития интенсивного ответатребуется их предварительное размножение).По этой причине подавляющее большинстворабот по изучению закономерностейактивации Т-лимфоцитов выполнены in vitro сиспользованием митогенных лектинов (ConA и ФГА),смеси ФМА с Ca2+-ионофорами (иономицин), или МА ккомплексу CD3-TCR. Каждый этап специфическойактивации Т-клеток invivo происходит в конкретноммикроокружении, полностью смоделироватькоторое в реальных условиях экспериментавряд ли представляется возможным.

Общепринятый фенотипнаивных CD4+Т-клеток человека может быть описан как CD45RA+CD45R0–CD25–CD29–CD62L+CD69–CD95–HLA-DR–. Большинство покоящихсянаивных CD4+CD45RA+CD45R0– Т-лимфоцитов, как и Т-клеткитимуса,являются чувствительными к действиюCa2+-ионофоров. Многократноевозрастаниеионов Ca2+всегда происходит наиболее резко в первыеминуты стимуляции Т-лимфоцитов и достигаетмаксимума в течение 5–10 мин.Следовательно, чувствительность к присутствию ионовкальция в среде и к действию иономицинаявляетсянеобходимым условием для осуществлениястадий индукции активации наивныхТ-лимфоцитов.

Чувствительностьранних этапов активации (от момента началаполиклональной стимуляции и до появления наповерхности Т-лимфоцитов молекул CD25) кприсутствиюионов кальция во внешней среде и ихзависимость от амплитуды роста внутриклеточногоCa2+ в ответ настимул признается большинствомисследователей. Данный этап активации попродолжительности колеблется от 8 до 12 ч.Этот же временной интервал принятохарактеризовать и по появлению молекул CD69.Экспрессиямолекул CD69 в активированных Т-клеткахполностью подавляется EGTA. Среди лимфоцитовИР-фракции присутствие CD4+CD45R0–CD45RA+CD69+ Т-клеток никогдане наблюдается. Скорее всего, большинствоCD4+CD45RA+CD45R0lowCD69+ Т_лимфоцитовчеловека представляют собойчувствительные к действию иономицина клетки.Возможно, до появления молекул CD25 наактивированных CD4+CD45R0–CD45RA+Т-лимфоцитах эти клетки и проходятнесколько этапов начальной стадии активации, но всеони не сопровождаются качественнымиизменениямиих чувствительности к действию иономицина.Следовательно, для инициации процессаактивации чувствительность Т-клеток киономицину совпадает с их наиболее сильнойзависимостью от присутствия Ca2+ в среде. Так какионы кальция всегда присутствуют ворганизме, то резистентность к действию иономицинапросто не может появиться на данном этапеактивации.

Одной из ключевыхстадий процесса активации принято считатьпоявление CD4+CD25+Т-клеток. Влияние удаления ионов кальция спомощью EGTA из среды на экспрессию молекулCD25 Т-клетками сильно зависело от времени добавленияхелатора. Как правило, чем на более ранней стадииионы кальция были удалены из средыинкубации клеток, тем большее влияние этооказывало на экспрессию молекул CD25. Скореевсего, для индукции синтеза молекул CD25de novoприсутствие ионов кальция абсолютнонеобходимо. Экспрессия молекул CD25 наактивированных Т-клетках, прошедших стадиюиндукции, значительно меньше зависит от EGTA.Для более поздних стадий активациикакого-либоэффекта EGTA на CD25+ Т-клетки отмечено не было. Этосвидетельствует о значительном снижениизависимостиэтой и, возможно, последующих стадийактивации Т-клеток от присутствия ионов кальцияв среде.

Доля CD4+CD25+ Т-клеток в составеИР-фракции лишь незначительно отличалась от ихсодержания в крови того же донора. Этопозволяет предположить появление ИР Т-клеток,в которых произошла перестройкагомеостаза ионов кальция, именно на даннойстадии активации in vivo CD4+Т-лимфоцитов. В популяции CD4+CD25+ Т-клеток ПКЧприсутствуют пролиферирующие ирегуляторные CD4+ Т-лимфоциты. Существуют ливзаимные переходы между CD4+CD25high и CD4+CD25low популяциями, досих пор остается неизвестным. Субпопуляцииэтих клеток проявляют неодинаковуючувствительность к Ca2+-ионофору.Большинство CD4+CD25highТ-лимфоцитов представлено резистентными кдействию иономицина клетками. В сравнении сCD4+CD25highТ-лимфоцитами ПКЧ, ИР-фракция всегдаобогащена HLA-DR+, CD95+и CD38+клетками с высоким уровнем экспрессииэтих молекул, но одновременно содержитменьше CD62L+клеток. В сравнении с CD4+CD25low Т-клетками ПКЧ, ИРпопуляция обогащена CD95+ клетками свысокимуровнем экспрессии этих молекул. При этом вИР-фракции CD4+CD25lowТ-лимфоцитов наблюдается выраженноеуменьшение доли CD62L+ клеток. Скорее всего, Т-клетки сизмененным гомеостазом ионов кальцияпоявляются на стадии интенсивнойпролиферации активированных CD4+ Т-лимфоцитов, носоставляют меньшую долю этой популяции. Впопуляции регуляторных CD4+CD25high Т-лимфоцитовдоля ИР-клеток значительно выше. Какие-либоданные о зависимости этих популяций отприсутствия ионов кальция в среде нанастоящий момент отсутствуют.

Появление молекул HLA-DRявляется общепринятым признаком позднейстадииактивации CD4+Т-лимфоцитов. Специальных работ поизучению роли ионов кальция в экспрессиимолекул HLA-DR не проводилось, но отмечаетсяминимальныйвклад кальмодулин-зависимых процессов (cAMP-или cGMP-зависимые протеинкиназы) в осуществление экспрессии.Доля ИР CD4+HLA-DR+Т-клеток всегда была значительно выше, чемв крови того же донора. Скорее всего, на позднихстадиях активации invivo большая частьактивированных CD4+ Т-клеток качественно изменяетхарактервнутриклеточной регуляции ионов кальция иприобретает резистентность к действиюиономицина.

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»