WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 10 |

Абсолютноеколичество (кл/л)

ОбщиеT-клетки

73 ± 12,0

0,946-2,079x 109

-T клетки

4,6 ± 2,8

5,3 ± 3,6

0,022-0,115 х109

-T клетки

70,5 ± 9,7

92,8 ± 5,6

0,924-1,964 х109

–Т-клеткиподразделяются на две различныенеперекрывающиеся субпопуляции. Клеткиодной из них несут маркер CD4 и в основном"помогают" в осуществлении иммунного ответа или"индуцируют" его, данная субпопуляцияполучиланазвание Т-хелперы. T-клетки другойсубпопуляции несут маркер CD8 и обладаютпреимущественно цитотоксической активностью.

Небольшая часть–Т-клеток не экспрессируют ни CD4, ниCD8. С другой стороны, большинство –Т-клеток, циркулирующих впериферической крови, также "дваждыотрицательны". Однако некоторые из –Т-клеток все же экспрессируют молекулы CD8.Напротив, большая часть –Т-клеток в тканях экспрессируют CD8. Кромемолекулы CD8 –Т-клеткина своей поверхности могут экспрессироватьCD56, CD94, CD161. Также былопродемонстрировано, что цитостатическуюактивность –Т-клетоквозможностимулировать через CD122 (-цепь рецептора IL-2) (Ichikawa Y., et al., 1991; Battistini L., et al., 1997; Fujimiya Y., et al., 1997).

–Т-клетки былиизучены относительно недавно. Одной изособенностей –Т-клеток в отличиеот –Т-клеток являетсято, что они распознают непептидные антигены,полученные из микробных патогенов,независимо от MHC. Данная субпопуляциявыполняет целый ряд важных функций, так онимогут усиливать иммунный ответ, производя большиеколичества интерферона-(IFN-), фактора некроза опухолей-(TNF-) и хемокины. Кроме этого, –Т-клетки имеют эффекторную(цитотоксическую) активность. С эволюционной точкизрения, -Т-клетки занимают уникальное местомежду высоко специфичными -Т-клетками иврожденнойиммунной системой для выполнения защитыорганизма от патогенов. Экспериментальныеданные показали, что роль -Т-клеток былавесьма существенна в устойчивостиорганизма против целого рядамикроорганизмов. Так функциональнуюзначимость -Т-клеток отмечали в устойчивости кMycobacterium,Borellia, Francisella tularensis, Salmonella и вирусов, включая вирус ВИЧ. Крометого, -Т-клетки играют существенную рольи в противоопухолевом ответе, в частности былоописано значительное увеличение этихклеток у пациентов с лимфомой. -Т-клетки такжевовлечены в восстановление эпителия игомеостаз. С другой стороны, –Т-клетки могут быть вовлечены впатогенез заболеваний с гиперактивацией иммуннойсистемы, например, сахарного диабета,болезни Бехчета, а также бронхиальнойастмы (IchikawaY., et al., 1991; McClanahan J., et al., 1999; Robak E., et al., 1999; Yin Z., et al., 2000).

Содержание -Т-клеток впериферической крови варьирует,существуют половые и возрастные различия. Ихколичество увеличивается с моментарождения донаступления полового созревания, а вдальнейшемпостепенно снижается. У женщин количество-Т-клетокнесколько выше, и этот уровень сохраняетсязначительнодольше, чем у мужчин (Caccamo N., et al., 2006).

-Т-клетки обладают очень быстрой(начинающейся после 4-6 дней), высокой (в 200 раз) идлительной(>7 месяцев) пролиферативной способностьюв ответ на антиген. Кроме того, в течениеиммунногоответа антиген-специфические -Т-клетки могутсоставлятьдо 48-98 % от общего количества циркулирующих-Т-клеток.Таким образом, обнаружение увеличеннойциркулирующей субпопуляции -Т-клеток может позволить сделатьпредположение о недавней илипродолжающейся хронической стимуляции,особенно на слизистых оболочках илиучасткахкожи. Эта информация позволяет клиницистамделать предположение о возможном медленнопрогрессирующем инфекционном заболевании(Chen Z.W., et al., 2003).

На клеточнойповерхности и -, и -антигенраспознающие рецепторы T-клетокрасполагаются непосредственно рядом сполипептидным комплексом, имеющимгрупповое название CD3. Это соседство и ассоциация с CD3 являютсянеобходимым условием для экспрессии всегорецепторного комплекса на поверхности клеток.

Приведенные вышефакты свидетельствуют в пользу того, чтодля более полной характеристики Т-клетокпациента анализ следует проводить нетолько по такому линейно-специфическомумаркеру как CD3, но и по наличию субпопуляций -T-клеток и –Т-клеток. Важность определенияпоследних становится очевидной для целогоряда заболеваний. В первую очередь к нимотносятся такие заболевания какВИЧ-инфекция, вторичные и первичные иммунодефицитныесостояния, сопровождающиеся длительнойперсистенцией микроорганизмов в организмечеловека нафоне депрессии Т-клеточного звена иммуннойсистемы. И особенно важным становитсяопределение –Т-клеток приоценке общего количества Т-клеток в тех случаях,когда от их количества зависит дозаназначаемых препаратов (например,назначение антиретровирусной терапииВИЧ-инфицированным пациентам).

Рис. 21. Гистограммыраспределения Т-клеток и их субпопуляций,полученные врезультате многоцветного анализалимфоцитов периферической крови сиспользованием комбинации моноклональныхантител CD3/CD4/CD8/CD45.Анализ проводили на CD45 позитивных клетках.

Количественный анализT-клеток является наиболее востребованнымисследованием для иммунологическогоконтроля состояний при синдромеприобретенного иммунодефицита (СПИД),мониторинга как за пациентами послетрансплантации костного мозга, так иэффективности иммунодепрессивной терапии.Стандартныепротоколы иммунофенотипирования,использующие четыре цвета, позволяют проводитьидентификацию субпопуляций T лимфоцитов водном образце (Рис. 21). Этот анализпредоставляет исследователю намногобольше информации, но до последнеговремени она находилась вне зоны вниманияклиницистов (Reimann K.A.,et al., 2000).

Рис. 22. Гистограммыраспределения Т-клеток по плотностиэкслрессии CD3 на их поверхности. А – распределениеCD3позитивных Т-клеток у здорового донора. Б -распределение CD3 позитивных Т-клеток у пациента свирусомЭпштейн-Бара.

Так, при использованиикомбинации МА CD3/CD4/CD8/CD45при обычном анализе периферическихT-клеток достаточно часто наблюдаетсябимодальноераспределение экспрессии CD3, котороепредполагает наличие двух отличныхсубпопуляции T-клеток (Рис. 22Б). Помимомолекул CD3 антиген-специфическийT-клеточный рецептор является другимпан-T-клеточным маркером, которыйнеобходимоиспользовать при анализе пациентов симмунологическими расстройствами. Как былоописано выше, существует два отличных типа TCR - -TCR и -TCR, которыеразличаются по происхождению в онтогенезеи функциональным свойствам. В медицинскойпрактике, как правило, вниманиеклиницистов сосредоточено, прежде всего, на -T-клетках,которыесоставляют большую часть T-лимфоцитов.Остающиеся около 5% -T-клеток, как правило, выпадают иззоны внимания клиницистов, и эти клеткирассматривали исключительно приисследовании иммунитета слизистыхоболочек и втимусе.

Данный этап необходим,так как большинство –Т-клеток, циркулирующих впериферической крови "дважды отрицательны"по CD4 иCD8. Другая ихособенностьзаключается в том, что они имеют болеевысокую плотность экспрессии молекулы CD3 на своейповерхности (CD3bright). На Рис. 22 изображенодостаточночасто встречающееся распределение CD3 положительныхлимфоцитов при бактериальных и вирусных инфекциях,первичных и вторичных иммунодефицитах. Как видно изРис. 23, клетки находящиеся в зонах А, Б и Вэкспрессируют высокий уровень CD3. В свою очередьклетки в зоне А имеют фенотип CD3brightCD4-, взоне Б CD3brightCD8dim изоне В CD3brightCD8-. Все эти признакихарактерныдля -T-клеток. Чтобы выявить - и -T-клеток, какправило, используют следующую комбинацию МА -TCR/-TCR/CD3/CD45.

Рис. 23. Гистограммыраспределения Т-клеток и их субпопуляций,полученные врезультате многоцветного анализалимфоцитов периферической крови пациентас хроническим носительством вирусаЭпштейн-Бара. В зонах А, Б и В находятся CD3bright Т-клетки.

На Рис. 24 представленыгистограммы распределения Т-клеток,полученные врезультате многоцветного анализалимфоцитов периферической крови пациента схроническим носительством вирусаЭпштейн-Бара. На Рис. 24А в квадранте F2 находятся -T-клетки, на Рис.24Б в квадранте Е2 - -T-клетки.

Все изложенное вышесвидетельствует в пользу того, что длянаиболее полной фенотипической характеристикиT-клеток необходимо проводить анализ нетолько линейно-специфичного маркераT-клеток CD3,но и определять субпопуляционный состав T-клетокпо экспрессии Т-клеточного рецептора, аименно - и-TCR. Для этих целейследует использовать многоцветный анализи следующиекомбинацииМА: CD3/CD4/CD8/CD45 и -TCR/-TCR/CD3/CD45.

Рис. 24. Гистограммыраспределения Т-клеток, полученные врезультатемногоцветного анализа лимфоцитовпериферической крови пациента с хроническимносительством вируса Эпштейн-Бара.

Таким образом, болееполная информация об экспрессииТ-клеточного рецептора в клинической практикезначительно расширяет возможности дляанализа состояния Т-клеточного звена иммуннойсистемы не только с точки зренияадекватного выявления его дефектов, но идля правильного назначенияхимиотерапевтических препаратов, направленных навосстановление нормальногофункционирования защитных систем организма.

Идентификациярегуляторных Т-клеток и Т-клетокпамяти.

В крови человекаприсутствуют как наивные Т-клетки, так иТ-клетки памяти, различающиеся между собой пофункциональным и фенотипическим признакам. Жизненныйцикл Т-клеток в организме делится на двефазы. Независимая от чужеродного антигенастадия дифференцировки Т-клеток и стадия,связанная с присутствием чужеродного антигена.Первая из них завершается появлением врусле кровизрелых наивных Т-лимфоцитов, каждый изкоторых способен отвечать только на«свой» антиген. Стимулированные антигеном входе первичного ответа Т-клетки проходятдальнейшую дифференцировку (Sprent J., 1994).

Все Т-клетки памятипоявляются в результате дифференцировкиактивированных антигеном наивныхпредшественников в ходе нормальногоразвития первичного иммунного ответа in vivo. Экспрессия наклеточной поверхности различных изоформмолекулы CD45 позволяет разделить CD4+ Т-лимфоцитычеловека на наивные Т-клетки и Т-клеткипамяти. Принято относить субпопуляциюCD4+CD45RA–CD45R0+ Т-лимфоцитов кТ-клеткам памяти и соответственно CD4+CD45RA+CD45R0– – к наивнымТ-клеткам (Рис. 25). Подобное разделениеосновано исключительно на способности CD4+CD45RA–CD45R0+ Т-клеток, а ненаивных Т-лимфоцитов, интенсивно отвечатьна повторный контакт с антигеном in vitro. В свою очередь,быстрый и усиленный ответ Т-клеток памятина специфический антиген является их важнейшимфункциональным отличием от наивныхпредшественников (Sanders M.E., et al., 1988; Michie, C.A., etal., 1992).

Покоящиеся CD4+ Т-лимфоциты памятитакже отличаются от наивных предшественниковсистемой внутриклеточной сигнализации,приводящей к резистентности к действиюСа2+-ионофоров. Чувствительная кдействию Са2+-ионофоров популяция CD4+ Т-клеток человека составляетосновную часть покоящихся наивных CD4+CD45RA+CD45R0– Т-лимфоцитов. В свою очередь,большинство резистентных к действиюСа2+-ионофоров CD4+Т-клеток являютсяпокоящимисяCD4+CD45RA–CD45R0+ Т-лимфоцитамипамяти (IshidaY., et al., 1988; Miller R.A., et al., 1991; Sigova A., et al., 1999; Хайдуков С.В.,и др., 2003).

Рис. 25 Распределениелимфоцитов условно здорового лица (А и В) ипациента впослеоперационный период (Б и Г). Нагистограммах В и Г анализ лимфоцитовпроводили только с гейтированием по CD45. Нагистограммах А и Б анализировали клетки припомощи многоэтапного гейтирования по CD45 и CD4.

Основная методическаясложность в исследованиях процессадифференцировки CD4+ Т-лимфоцитов в периферической кровиздоровых лиц связана с тем, чтоактивированные клетки составляют лишьнезначительную часть. Как правило, в кровиздоровых лиц доля активированных CD4+ Т-клетоксоставляет менее 10% от общего числаCD4+Т-лимфоцитов (Reimann K.A., et al., 2000).

Однозначнымфенотипическим признаком дифференцировкипокоящихся наивных CD4+CD45RA+CD45R0– Т-лимфоцитовчеловека в покоящиеся Т-клетки памяти принятосчитать появление на поверхности клетокмолекул CD45R0 взамен изоформы CD45RA. Даннаяособенность позволяет выявить трисубпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов человека: покоящиесянаивные CD45RA+CD45R0– T-клетки, покоящиеся CD45RA–CD45R0+ T-клетки памяти иактивированные – CD45RА+CD45R0+Т-клетки (рис. 25). Все активированныеCD4+CD45RA+CD45R0+ Т-лимфоцитывозникают впроцессе стимуляции наивных Т-клеток антигеномin vivo (Sanders M.E., et al., 1988;Michie, C.A., et al., 1992).

Рис. 26 Алгоритманализа субпопуляций CD4+CD25+ Т-лимфоцитовчеловека:CD4+CD25high – зона E, CD4+CD25low – зона D, CD4+CD25– – зона C. В однопараметрическихгистограммах представлено распределениямолекул CD95+на CD4+CD25high, CD4+CD25lowи CD4+CD25– Т-лимфоцитах.Распределения молекул CD38, CD62L и HLA-DR наповерхности CD4+CD25high, CD4+CD25lowи CD4+CD25– Т-клетокоценивалось аналогичным способом.

Появление молекул CD69считают основным фенотипическим признакомнаиболееранней (первые часы) стадии активациинаивных CD4+Т-лимфоцитов. Как правило, в крови здоровыхлиц не удается обнаружить присутствие более чем1–4% CD4+CD69+ Т-клеток (Gerosa F., et al., 1991; Mascher B., et al., 1999; Pala P., et al., 2000).

Определениеотносительного количества CD4+CD45RA+CD45R0– иCD4+CD45RA–CD45R0+ лимфоцитов можетслужить хорошим диагностическим признаком.Этот эффект четко проявляется при развитииинфекции или при хирургическомвмешательстве, поскольку происходитнакопление доли CD4+CD45RA–CD45R0+клеток и снижение CD4+CD45RA+CD45R0–. Как видно из Рис. 25, определениеотносительного количества CD45RA+ и CD45R0+ клеток по всейпопуляциилимфоцитов мало информативен и толькоанализ по зоне CD4 позитивных клеток позволяет четкоувидеть это различие.

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»