WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 10 |

Циркулирующие зрелыеNK-клеткиимеют фенотип CD3-CD56+CD16+CD2dimи отличаются от T-клеток отсутствиемT-клеточного рецептора и CD3. В свою очередь, отличие отB-клеток заключается в том, что NK-клетки никогда неэкспрессируют мембранныеиммуноглобулины (Ig), однако, за счет экспрессии FcRIII, они могут бытьпозитивными при окрашивании антителами.Поверхностные маркеры, экспрессируемыеактивированными NK-клетками, включают целый рядмолекул,таких как CD25,1 (CD29) и2 (CD18) интегрины, различныеактивационные антигены, включая HLA-DR, CD71 и CD69. Взависимости от степени активации NK-клетокповерхностные рецепторы могут изменятьсвою экспрессию за счет повышения илипонижения (WhitesideT.L., et al., 1994; Rabinowich H., et al., 1993).

Рис. 16.Гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови сиспользованием моноклональных антителпротив CD3 иCD8,меченныхFITC и PE. На даннойгистограммеотображены только CD45 позитивные лимфоциты. В зонеI1 находятсяCD8+ NK-клетки.

Популяция NK-клеток обладаетдостаточной гетерогенностью по своемусоставу.Исследователи выделяют несколько их субтипов, аименно пре-NK-клетки, зрелые NK-клетки иактивированные NK-клетки. Данная особенностьсвязана с различной экспрессией маркеровклеточной поверхности. Среди популяциициркулирующих NK-клеток выделяют две основныесубпопуляции. Первая экспрессирует CD16 и низкийуровень CD56 (CD16+(or high)CD56dim). Вторая экспрессирует CD56, однако, CD16 на нихпредставлен в низкой плотности илиполностью отсутствует (CD16-(or low)CD56bright). Последняя субпопуляциясоставляет приблизительно 10-20 % от общего количестваNK-клеток. Онисекретируют IFN- и другиецитокины, иимеют меньшую цитолитическую активность. Всвою очередь субпопуляция CD16highCD56dim составляетприблизительно 80-90% от NK-клетокпериферической крови, они слабосекретируют цитокины, но обладают высокойцитолитической активностью (WarrenH.S., et al., 1991).

Перечень другихмаркеров, экспрессируемых на своей поверхностиNK-клетками, достаточно широк. Это – CD2, CD5, CD7, CD8, CD94, CD96, CD158, CD159 и многие другие.В настоящее время для локализации ихарактеристики NK-клеток наиболее широко используютдвухпараметрический анализ экспрессии CD16 и/или CD56 на CD3-негативныхклетках. Данная комбинация МА позволяетлокализовать общую популяцию NK-клеток иколичественно ее охарактеризовать (Рис. 15),но не охарактеризовать их субтипы.

Достаточно частоNK-клетки экспрессируют на своейповерхности -цепь CD8 (Рис. 16), но в более низкойплотности, чем цитотоксические Т-клетки.Функция CD8 уNK-клеток до последнего времени была неясна,однако было показано, что субпопуляции NK-клеток человека,экспрессирующие гомодимер CD8 обладают большейцитотоксичностью, чем CD8-NK-клетки, номеханизмы этого оставались неизвестными.Позднее выяснилось, что соединениеCD8 цепей вгомодимер индуцирует быстрое повышениевнутриклеточного Ca2+ и, инициированное этим, увеличениеэкспрессии CD69. Хотя секрецияцитолитических ферментов инициирует апоптозNK-клеток,приток экзогенного кальция защищает CD8+NK-клетки отданного процесса. Данная защита от апоптоза можетбыть снята преинкубацией NK клеток сантителами против MHC класса I. Таким образом, данныймеханизм позволяет CD8+ NK-клеткам сохранятьжизнеспособность и принимать участие вмногократном лизисе клеток-мишеней.

В последние годыисследователи уделяют большое вниманиеэкспрессии CD38 на поверхности NK-клеток. МолекулаCD38 этомембранный гликопротеин, представляющийсобой фермент, регулирующий концентрациюцитоплазматического кальция. Кроме этого данныйфермент обладает целым рядом другихактивностейтаких, как аденозиндифосфат (ADP) рибозилциклазная, циклический аденозиндифосфатрибозил гидролазная и NAD гликогидролазная. Данная молекулатакже играет роль рецептора, модулируямежклеточные взаимодействия, иявляетсяпереносчиком трансмембранных сигналов.Молекула CD38экспрессируется на активированных Т-, В-,NK-клетках инекоторых других типах клеток.

В ряде работ приведеныданные о том, что обработка CD38+ NK-клетокантителамипротив CD38 приводит к активации ихлитической способности. Однако это происходилотолько в тех случаях, когда быловозможновзаимодействие CD38 со специализированнымисигнальными молекулами. В случае NK-клеток рольтакоймолекулы играет CD16.

Представленные вышеданные свидетельствуют в пользу того, чтодля наиболееполной характеристики NK-клеток необходимо определить наCD3-негативных клетках следующиеповерхностные маркеры: CD16, CD56, CD38 и CD8. В свою очередьследует отметить, что CD38 и CD8 позволяютоценить цитотоксическую активность NK-клеток пациента и,как следствие этого, более корректнопредставлять картину, происходящую наданном этапе развития иммунного ответа. Для этихцелей рекомендуется использовать следующиекомбинации МА: CD3/CD16/CD56/CD45 и CD3/CD8/CD38/CD45.

Как уже было сказановыше, применение двухцветного окрашиваниялимфоцитов сиспользованием комбинации антител CD3, CD56+CD16 позволяетлокализовать NK-клетки и оценить их абсолютное иотносительное количество (Рис. 15).Однако в этом случае отсутствуетвозможность определить их субтипы.

Другим вариантомокрашивания лимфоцитов для выявленияNK-клетокявляетсяиспользование комбинации антител CD16 и CD56. На Рис. 17Апредставлена двухпараметрическаягистограмма распределения лимфоцитовпериферической крови с использованием МА противCD16 и CD56, меченных FITC и PE. Но в этом случаерезультат получается несколькозавышенным, поскольку дополнительный вкладвносят Т-клетки, так как они могутэкспрессировать на своей поверхности CD56 и CD16. Это особенноярко проявляется при наличии различныхпатологий,когда резко возрастает количествоТ-клеток, экспрессирующих данныеструктуры.

Рис. 17. Гистограммыраспределения лимфоцитов периферическойкрови сиспользованием моноклональных антителпротив CD16 иCD56,меченныхFITC и PE. На гистограмме Аотображены все CD45+позитивные лимфоциты. На гистограмме Б отображенытолько CD45+CD3-лимфоциты.

Данную задачупозволяет решить применение многоцветногоанализа и следующей комбинации МА CD3/CD16/CD56/CD45. В даннойкомбинации CD3 позволяет исключить из анализаТ-клетки (Рис. 17Б).

Рис. 18.Гистограмма распределения лимфоцитовпериферической крови с использованиеммоноклональных антител против CD8 и CD38, меченных FITC и PE. На даннойгистограмме отображены только CD45 позитивныелимфоциты.Область Н содержит CD8+CD38+ NK-клетки.

Ранее сообщалось, чтоCD38+CD8+ NK-клетки обладаютвысокой цитолитической активностью. Таким образом,знание о наличии данной субпопуляции, ееотносительном и абсолютномколичестве имеет важное диагностическоезначение.

Для локализации CD38+CD8+ NK-клеток возможноиспользовать двухпараметрическийанализ (Рис. 18), но более корректноприменять трех- и четырехцветный анализ (CD3/CD8/CD38 и CD3/CD8/CD38/CD45).

В случае использованиякомбинации CD3/CD8/CD38для выделения лимфоцитов используют морфологическиепараметры, но в результате этого всегдасуществуетвероятность исключить из анализа частьбольших гранулярных лимфоцитов, которыемогут простоне попасть в выделенную зону пригейтировании. Использование CD45 для локализациивсей популяции лимфоцитов являетсяболеекорректным.

Комбинациямоноклональных антител CD3/CD8/CD38/CD45 и многоэтапное позитивное инегативное гейтирование позволяет четковыделить активированные NK-клетки. На Рис. 19А представленадвухпараметрическая гистограммараспределения лимфоцитов периферическойкрови с использованием МА против CD3

Рис. 19. Многоцветныйанализ и последовательное гейтированиедля локализации активированных NK-клеток.А - гистограмма распределения лимфоцитовпериферической крови с использованием CD3 и светорассеянияпод углом 90о.Область Dсодержит Т-клетки, а область C - CD3 негативныелимфоциты. Б - гистограмма распределенияCD3- лимфоцитовпериферической крови с использованием CD8 и CD38. CD8dimCD38+ активированныеNK-клетки. В - гистограмма распределенияCD3+ лимфоцитовпериферической крови с использованием CD8 и CD38. CD8brightCD38+ активированныецитотоксические Т-клетки.

Дальнейший анализпроводят на отдельных гистограммах сиспользованием логических ограничений взонах позитивных и негативных по CD3. Нагистограмме,полученной сиспользованием гейтирования по CD3+, в зоне второгоквадранта находятся активированныецитотоксические Т-клетки с фенотипомCD8brightCD38+(Рис. 19В).

Гейтирование по зонеCD3негативных клеток, позволяет выявитьактивированные NK-клетки с фенотипом CD8dimCD38+(Рис. 19Б). Данное утверждение правомерно, посколькуCD8экспрессируется не только на Т-клетках, нои на частипопуляции CD3негативных клеток, а именно на NK-клетках.

Таким образом,используя данную комбинацию, МА возможно водном образце определить активированныецитотоксические Т-клетки и активированные NK-клетки.

В последние годыстановится весьма очевидной необходимостьпри типировании NK-клеток выявлять как общееколичество, так и содержание отдельных ихсубпопуляций. Это связано с большимколичеством вновь полученногофактического материала и несколькиминаправлениями развития современнойиммунологии.

Результатыисследований показали, во-первых, ведущеезначение NK-клеток и их цитотоксическойфункции при опухолевых ивирус-индуцированных процессах.

Во-вторых, наличиерегуляторной функции у отдельныхсубпопуляций NK-клеток ставит вопрос об ихклиническом и патогенетическом значении.

В-третьих, данные оналичии активационных рецепторов NK-клетокпозволяютпо-новому оценить их функциональнуюактивность, не ставя трудоемких и весьмазатратных экспериментов по киллингуклеток-мишеней.

В-четвертых, появиласьвозможность оценить степень воздействиялекарственной терапии на собственноNK-клетки какв норме, так и патологии, как in vivo,так и invitro. Этопозволяет значительно расширитьвозможности клинической фармакологии по поискусредств, напрямую влияющих на данную группуклеток (химиотерапия опухолей,антивирусная терапия и др.).

И, в-пятых, изучениесубпопуляций NK-клеток и их функциональнойактивностиможет повлиять на наши представления оприроде патологических процессов. Это весьмаважно как для известных патологий, гдезначение NK-клеток уже определено, так и длядругих процессов, при которых значимостьврожденных механизмов иммунитета недостаточноизучена. Как следствие этого, новые данныемогутспособствовать более корректнойиммунотерапии различных патологическихсостояний с учетом ее влияния на данныеклетки.

ИдентификацияТ-клеток и их субпопуляций по экспрессии -TCRи -TCR.

Многие микроорганизмыявляются внутриклеточными паразитами и,обитая внутри клеток организма-хозяина,недоступны для антител. Облигатныевнутриклеточные паразиты, в частностивирусы, способны размножаться тольковнутри клеток, используя репликационнуюсистему клеток хозяина. Факультативновнутриклеточные микроорганизмы, такие какмикобактерии и лейшмании, могутразмножаться как в клетках, главнымобразом в макрофагах, так и вне клеток, новнутриклеточный способ существованиядля них более предпочтителен, посколькуобеспечивает защиту от факторов иммунной системы.Против данных микроорганизмов действуетособыймеханизм приобретенного иммунитета, аименно клеточный иммунитет. Он обеспечиваетсяотдельной субпопуляцией лимфоцитов,получившей название Т-клетки. В отличие отВ-клеток, они дифференцируются в тимусе.Т-лимфоциты специализируются на уничтоженииклеток организма, которые инфицированыразмножающимися внутриклеточновозбудителями инфекции. Т-лимфоциты играютважную рольв элиминации опухолевых клеток, в реакцияхтрансплантат против хозяина и хозяинпротив трансплантата, гиперчуствительности замедленноготипа и других реакциях организма,направленных на поддержание гомеостаза.

Оценка какотносительного, так иабсолютного количества Т-клеток и ихосновныхсубпопуляций получила широкоераспространение в лабораторнойпрактике.При фенотипировании лимфоцитов эти данныеявляются диагностически значимыми при различныхпатологических состояниях иммуннойсистемы, включая первичные и вторичныеиммунодефициты. Динамика изменениясубпопуляционного состава Т-клеток принекоторых патологиях представляет собойзначительную ценность для контроляэффективности терапии, прогноза развития итечения заболевания (Hayball J.D., et al., 2000; Mandy F.F., et al., 2003).

К маркерам,характеризующим T-клетки, в первую очередьотносят Т-клеточный рецептор (T-Cell Receptor, TCR).Подобно В-лимфоцитам, Т-лимфоциты несут насвоей поверхности специфический рецептордля распознавания антигена. TCR являетсягетеродимером, состоящим из двух цепей.

Существует два типа TCR,каждый из которых ассоциируется с разнымитипамиT-лимфоцитов. TCR1, состоящий из - и -цепей, появляетсяна ранних стадиях онтогенеза. TCR2состоитиз - и -цепей (Davis M.M., et al., 1988; Autran B., et al., 1989; Jarry A., et al., 1990;Van den Beemd R., et al., 2000).

Гены -и -цепей T-клеточного рецептораорганизованы так же, как и гены иммуноглобулинов.Имеются также сегменты V, D и J и геныконстантныхобластей (С). Формированиеиммунокомпетентных T-клеток сопровождаетсятранслокацией фрагментов V, D и J собразованием непрерывной последовательностиVDJ. Как и присинтезе иммуноглобулинов, образованиемРНК предусматривает удаление интронов между VDJ и С.

Рис. 20. Гистограммыраспределения Т-клеток экспрессирующих TCR-V. Квадранты С2 содержатклетки с фенотипом CD3+TCR-V1+ и CD3+TCR-V14+.

Следует отметить, чтоуже выявлена специфичность отдельныхвариантовV-сегментаТCR. ТакV17 являетсямишенью для суперантигена микоплазмы(MAS) истафилококкового энтеротоксина B, а V8 длястафилококкового энтеротоксина Е. Описано,что при инфицировании вирусом Эпшейн-Баранаблюдалась быстрая клональнаяпролиферация CD8+ Т-клеток, экспрессирующих TCRV14, хотя внорме TCR V14 Т-клетки составляют только 2-7% (Рис. 20) (Haynes B.F., et al., 1995; Van den Beemd R., et al., 2000; Kelsen J., et al., 2004; Wada T., et al., 2007). Не исключено,что в будущем анализ наличия тех или иныхV-субъединиц TCR может бытьиспользован для персонифицированной терапиипациентов.

Примерно 87,2-98,4 %Т-клеток представляют собой вариант -TCR, и обозначаются эти клетки как –Т-клетки. Остальные 1.7-8.9 % T-клетокнесут на своей поверхности -TCRи обозначаются как –Т-клетки (Таблица 4).

Таблица 4. Среднестатистическое содержание-Tклеток и -T клеток в периферической крови взрослыхусловно здоровых лиц (N = 60).

Субпопуляции

Относительно лимфоцитов (%)

Относительно общих Т-клеток(%)

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»