WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 10 |

Использование двухэтих параметров позволяет в гетерогеннойпопуляции клеток локализовать все входящие внее компоненты. Данная процедурапроизводится за счет использования«гейтирования». GATE (ворота) – логическиограниченная область клеток сопределенными характеристиками нагистограмме их распределения, позволяющаяанализировать события, заключенныеисключительно в данную область.Гейтирование (от gating) – введение данныхлогических ограничений из одной гистограммы в другие.Данная функция позволяет отображать ианализировать события, попадающиеисключительно в интересующую насобласть.

Примером могут служитьлейкоциты периферической крови, состоящиеиз лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов (Рис. 2).При анализе периферической кровинеобходимо соблюдать правило: все основныепопуляцииклеток должны быть отображены нагистограмме распределения клеток по двумсветорассеяниям, что облегчит работу.

Использованиеморфологических параметров (FS и SS) для локализациилимфоцитовдостаточно часто приводит к получению некорректныхрезультатов. Это бывает связано, какправило, с неполным лизисом эритроцитов,попаданием базофилов в зону лимфоцитов и т.д. Длядиагностики состояния иммунной системы и ее аномалийболее корректным представляется локализациялимфоцитов, опираясь на экспрессию общегодля лейкоцитов антигена (CD45) в многоцветноманализе (анализ больше трех цветов) имногостадийное гейтирование. Впоследнеевремя все чаще используется методлокализации лимфоцитов именно по наличию CD45.

Рис. 3. Оптимизациянастройки каналов флуоресценции.Негативные клетки должны находиться всередине первой декады логарифмическойшкалы интенсивности флуоресценции (А). Б и В- примерынеправильной настройки цитометра. Б -слишком высокое напряжение на ФЭУ. В -слишкомнизкое напряжение на ФЭУ.

Оптимизациянастройки параметровфотоэлектронных умножителей (ФЭУ) дляфлюоресценции. Посленастройки каналов светорассеянияприступают к настройке чувствительностиканалов флюоресценции. Этот процессначинают с анализа негативного контроля,который представляет собой клетки образца,окрашенныенеспецифическими антителами мечеными темиже флуорохромами с которыми предстоит работать вдальнейшем (изотипический контроль).Негативныеклетки должны попадать в первую декаду налогарифмической шкале интенсивности флюоресценциипо всем задействованным каналам (Рис. 3А).Необходимо добиться того, чтобы клетки контролялегли, по возможности, в центре первойдекады.Следует сразу отметить, чтонеспецифическое взаимодействие антителразличныхклассов с поверхнос тью клеток мишеней неодинаково. Исходя из этого, антитела дляконтрольного образца должны быть того жеизотипа и в той же концентрации, что и МА к CDмаркерам, используемые для анализа.

На Рис. 3Б и Рис. 3Вприведены гистограммы, полученные нацитометрах, настроенных некорректно. Есликонтрольные клетки попадают во вторуюдекаду, это, в конечном счете, можетпривести к ложно-позитивным результатам (Рис. 3Б),а низкая чувствительность приводит кзанижению реальных значений (Рис. 3В). И то идругое при клинико-диагностическихисследованиях недопустимо.

Оптимизация введения коэффициентовкомпенсации. Посленастройки чувствительности прибора в случаемногоцветного анализа возникают проблемы.Даже в случаях использования для анализалинейных маркеров, таких как CD19 и CD3, можно увидетьдубль позитивные клетки, хотя они в природене встречаются. Данный парадокс связан с тем, чтоспектры, испускаемые флуорохромами, небывают точечными, а имеют своераспределение в определенном диапазоне.Практически невозможно избежатьдополнительного вклада излучения во всеФЭУ, предназначенные для регистрации другихфлуорохромов, даже если использоватьразличные наборы барьерных светофильтров.Таким образом, необходимо провестивычитание изобщей интенсивности флуоресценции накаждом ФЭУ дополнительного сигнала,генерируемого другими флуорохромами.Данное вычитание называется введением впрограмму анализа коэффициентовкомпенсации.

Рис. 4.Гистограмма распределения клеток периферическойкрови иллюстрирующая первое правиловведениякоэффициентов компенсации. Значениям MEAN X и MEAN Y соответствуютзначениямаксимумов проекций гистограммраспределения клеток на оси X и Y.

В процессе анализарегистрируется ряд статистическихпараметров, среди которых есть такое значение какMEAN (рис 4).Этот параметр отражает среднестатистическоеположение максимума пика распределениячастиц на гистограммах в выбранном каналефлюоресценции или светорассеяния. Для процедурывведения коэффициентов компенсациинеобходимо использовать клетки,окрашенные антителами, связанными с разнымифлуорохромами, (например, CD3-FITC и CD19-PE) и анализироватьих в двухпараметрическом режиме. Антителадля этой процедуры подбирают таким образом,чтобы они относились к двумнепересекающимся CD маркерам. Гистограмму разбиваютна четыре квадранта, в которых определяютзначение MEANдля каждого типа флуоресценции. Первоеправило введения коэффициентов компенсации гласит:коэффициенты компенсации введеныправильно,если MEANквадранта 1 равен MEAN квадранта 3 по оси Х, а MEAN квадранта 4 равенMEAN квадранта3 по оси У (рис 4).

Рис. 5.Гистограмма распределения клеток периферической кровииллюстрирующая второе правиловведениякоэффициентов компенсации.

Второе правилооптимизации введениякоэффициентов компенсациигласит: если мысленно нарисовать линии изцентров областей позитивных клеток, то онидолжны быть приблизительно параллельныосям X иY или долженобразоваться прямоугольник (рис 5).

Рис. 6. Примерынеправильного использованиякоэффициентов компенсации. При недокомпенсации (А): MEAN квадранта 4больше, чем MEAN квадранта 3 по оси У, а MEAN квадранта 1больше, чем MEAN квадранта 3 по оси Х. Приперекомпенсации (Б): MEAN квадранта 3 больше, чемMEAN квадранта4 по оси У, а MEAN квадранта 3 больше, чем MEAN квадранта 1 по осиХ.

Всегда существуетвероятность пере- или недокомпенсации. НаРис. 6 представлены оба этих случая. Принедокомпенсации исследователь можетполучить завышенный результат и ложнопозитивные клетки (рис 6А). Приперекомпенсации можно потерять часть позитивныхклеток и, как следствие этого, получитьзаниженныйрезультат(рис 6Б).

Рис. 7. Оптимизация двухпараметрическогоанализа FITC(FL1) противPE (FL2) при изменениичувствительности одного из каналовфлуоресценции: А - низкая чувствительностьпо FL2; Б -повышение чувствительности по каналуфлуоресценции FL2 за счет увеличения напряжения наФЭУ; В - вычитание дополнительного вкладаинтенсивности флуоресценции FITC за счетувеличениякоэффициента компенсации.

Между напряжением наФЭУ и коэффициентами компенсациисуществует взаимосвязь. В некоторыхслучаях, когда используют МА от разных фирмпроизводителей, возникает необходимостьизменить чувствительность по одному изканаловфлюоресценции. Эта процедура приводит к тому, чтоизменяется и отображение флюоресценции надвухпараметрических гистограммах. Повышаячувствительность по одному из каналов,необходимо изменить и соответствующийэтому каналу коэффициент компенсации. Например, вдвухпараметрическом анализе FITC против PE, задействованыдва канала флюоресценции (FL1 и FL2). Для повышениячувствительности по каналу флюоресценцииFL2 поднимаютнапряжение на ФЭУ. При этом наблюдаетсядополнительный вклад интенсивностифлуоресценции FITC в канал FL2, который необходимо вычесть засчет увеличения коэффициента компенсации (Рис. 7).

Таким образом,алгоритм настройки рабочего протоколавыглядит следующим образом: проверкаработы цитометра; настройкадискриминатора; настройка каналовсветорассеяния; настройка каналовфлюоресценции; введение коэффициентовкомпенсации.

Предложенный подходдля настройки проточных цитометров ипоследующего анализа окрашенных клетокприменим к большинству производимыхцитометров.

Стандартные настройкии создание протоколов позволяют болеекорректно проводить анализ как вклинико-диагностических, так инаучно-исследовательских целях. В своюочередь, это позволяет использоватьподготовленные протоколы для исследованийи включать или исключать те или иныепараметры в анализ, в зависимости от целейпоставленных перед врачом-лаборантом илинаучным работником.

Идентификациясубпопуляций В-клеток.

При оценкеотносительного количества и характеристикклеток, участвующих в иммунном ответе наантигены, очень важно иметьпредставление обо всех типах клеток,участвующих в формировании специфического(адаптивного) иммунного ответа организмана внедрение патогена. При формированиииммуннойреакции одна из ведущих ролей принадлежитклеткам тимического происхождения,получившихназвание Т-лимфоциты. В то же времяэффекторные механизмы специфическойиммунореактивности обеспечиваются либоэффекторными Т-клетками (Т-эффекторами ГЗТ,цитотоксическими Т-клетками), либоспецифическими гуморальными факторами, секретируемыеопределенной субпопуляцией лейкоцитов.Специфический гуморальный иммунный ответобеспечивают хорошо всем известные антитела. Ониобладают способностью взаимодействовать свнедрившимися микроорганизмами,активировать систему комплемента истимулировать фагоцитарную активностьклеток-фагоцитов, взаимодействуя с ихмембранными рецепторами.

Популяцией лимфоцитов,отвечающей за продукцию антител, являются В-клетки.Каждый лимфоцит, относящийся к В-клеткам,запрограммирован на продукцию антителодной-единственной специфичности, и этиантитела присутствуют на его поверхности в качестверецептора для соответствующего антигена. ОдинВ-лимфоцит несет на своей поверхностипримерно 105идентичных молекул антител. Данныеантитела называют поверхностным илимембранными иммуноглобулинами (Робсон А., и др.,2006).

Рис. 8Гистограмма распределения CD3 и CD19 на лимфоцитахпериферической крови. CD3-CD19+В-клетки (квадрант J1), CD3+CD19- Т-клетки (квадрант J4).

Основной формоймембранных иммуноглобулинов являютсяиммуноглобулины класса М (IgM). Ониэкспрессируются на мембране всех зрелыхВ-клеток, которые не имели контакта сантигеном. Однако, на поверхности В-клеток,дифференцировка которых ужезавершилась, присутствуют ииммуноглобулины класса D (IgD). В процессеформирования иммунного ответа происходитпереключение изотипов мембранныхиммуноглобулинов на IgG, IgA, IgE (Ярилин А.А.,1999).

Кроме мембранныхиммуноглобулинов, В-клетки экспрессируютцелый ряд мембранных маркеров, которыенеобходимы для формирования В-клеточногорецептора(BCR) и играют важную роль в передаче сигналав процессе распознавания антигена, атакже являются маркерами линейной принадлежностиB-клеток, чтоособенно полезно при идентификации даннойпопуляции лимфоцитов. К таким маркерам,прежде всего, относятся CD19 и CD21. Данныемолекулы формируют ко-рецепторный комплекс, вкоторый вовлечен также и CD81 (Hultin L.E., et al., 1993).

Рис. 9Гистограмма распределения CD20 и CD5 на лимфоцитахпериферической крови у пациента сревматоидным артритом.

CD19 антиген (такжеизвестный как B4) - представляет собоймембранный гликопротеин, принимающий участие врегулирование развития B-лимфоцитов, ихактивации и дифференцировки. Эта молекулаэкспрессируется на всех нормальных B-клетках,включая про-B-лимфоциты, но исчезает уплазматических клеток в процессе ихсозревания. Молекула CD19 отсутствует намембране нормальных T-клеток, NK-клетках,моноцитах и гранулоцитах (Рис. 8). В связи сэтим данный антиген рекомендуется дляколичественной оценки общей популяцииB-клеток (HultinL.E., et al., 1993).

Кроме перечисленныхвыше структур, в состав В-клеточногорецепторного комплекса вовлечены и другиемолекулы, например CD20 - интегральный не гликозилированныймембранный белок. Данная молекула являетсяCa2+-каналом и участвует в активации ипролиферации В-клеток за счет регуляциитрансмембранной проводимости ионов Ca2+.Молекула CD20 присутствует на всехнормальных B лимфоцитах периферической крови,лимфатических узлов, селезенки, миндалин икостного мозга, но отсутствует наплазматических клетках (Hultin L.E., et al., 1993).

Иногда длялокализации В-клеток используют CD20, ноданная молекула может экспрессироваться в низкойплотности на других популяциях лимфоцитов.Хотя CD20 первоначально был описан какB-клеточный линейный маркер, оказалось, чтонебольшая субпопуляция Т-клеток человекаэкспрессирует CD20. Причем, B-клетки экспрессируют CD20 ввысокойплотности (CD20bright), а T-клетки в низкой (CD20dim) и составляют 2.4 +/-1.5 % от лимфоцитов периферической крови.

Хотя оценкаэкспрессии CD20 полезна при характеристикеB-клеток, необходимо достаточно осторожноподходить к интерпретации получаемыхрезультатов(Рис. 9). Особенно это относится к случаямфенотипирования костного мозга. Сходнаяпроблема может возникнуть прифенотипирования периферической крови у пациентов с ревматоиднымартритом.

Рис. 10.Гистограмма распределения CD5 и CD19 на лимфоцитах периферическойкрови. Субпопуляции В-клеток: CD19+CD5+ В-1(квадрантG2); CD19+CD5-B-2 (квадрантG1).

В настоящее времясреди В-клеток выделяют три основныесубпопуляции, а именно: В-1, В-2 и В-клеткипамяти.Достаточно важная роль при данном деленииотводится молекуле CD5 (Рис. 10). CD5 обнаружен на всехзрелых T-лимфоцитах и на большинстветимоцитов. CD5 также присутствует насубпопуляциях B-лимфоцитов, ноотсутствует на гранулоцитах и моноцитах.Молекула CD5является лигандом для CD72 антигена, которыйприсутствует на B-лимфоцитах. Точнаяфункциональная роль CD5 все еще до концане изучена, однако для этих молекул былапоказана физическая ассоциация сантиген-специфическим рецепторным комплексомкак на T-, так и на B-лимфоцитах и возможностьмодулировать передачу сигналов через этоткомплекс. Впоследние годы было показано, что CD5 можетбыть посредником негативной регуляции при передачисигналов дляBCR.

Кроме роли, связаннойс передачей сигналов при активации,молекула CD5 была расценена как возможный маркерB-клеток, позволяющий различать ихсубпопуляции: CD5+ B-клетки (также называемые B-1клетки) и CD5- B-клетки (или B-2 клетки) (Рис.10).

Рис. 11. Гистограммыраспределения CD5 и CD19 на лимфоцитах периферической крови.Субпопуляции В-1 лимфоцитов у пациента К. саутоиммунным тиреоидитом: А - до лечения;Б – впроцессе лечения.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»