WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 10 |

Для анализа окрашенныхклеток и настройки были использованыследующиепроточные цитометры: EPICS XL, EPICS XL-MCL, EPICS “Elite”, EPICS “Altra”, Cytomics FC500, Cytomics FC500 MPL (Beckman Coulter, США), FACSCalibur (Becton-Dickinson, США) и PAS-III (Partec GmbH, Германия).

Для корректногоисключения из зоны анализа всех частиц,которые не соответствовали по размерам игранулярности живым лимфоцитам, вводилинеобходимыелогические ограничения в гистограммыраспределения частиц по малоугловому, боковомусветорассеянию и CD45. Математическуюобработку цитометрических данных проводили при помощипрограмм EXPO-32и CXP v. 2.2(Beckman Coulter, США). В каждойпробе анализировали не менее 104 клеток. Абсолютные значенияполучены как в одноплатформенной (с помощьюреагента FlowCount (Beckman Coulter, США)), так и вдвухплатформенной (с использованиемрезультатовгематологического анализа) системах.

Статистическаяобработка результатов.Статистическая обработка результатов проводилась сиспользованием стандартного пакетаприкладных программ «Statistic forWindows 6.0».Полученные данные обрабатывалидискриптивными методами и представляли в видесредней арифметической и её стандартнойошибки(M±m).

Проточная цитометриякак современный метод анализа в биологии имедицине.

Проточная цитометриякак современная технология быстрогоизмерения характеристик клеток появилась врезультате естественного развитиятрадиционных гистохимических и цитохимическихметодов анализа. Созданная для ускоренияанализа вклинической цитологии и цитодиагностике,эта технология постепенно развилась в эффективныйподход к решению многих важных задачбиологии клетки, иммунологии, клеточнойинженерии ит.д.

Две существенныеособенности проточной цитометрии делаютэтот метод особенно ценным дляклиническойпрактики:

- во-первых, этот методпозволяет охарактеризовать гетерогенныеклеточные популяции по фенотипу. Анализытакого рода служат для выявленияотклонений,происходящих в процессе онкогенеза.Большинство современных примененийцитометриисвязано в первую очередь с анализами пофенотипу;

- во-вторых, этоспособность обнаружить и охарактеризоватьредкие события, т.е. встречающиеся с частотой10-5-10-7, что возможноблагодаря огромной производительности. Так,современные цитометры могутрегистрировать несколько параметров для каждойотдельной клетки со скоростью до 100000клеток в секунду.

Информация,извлекаемая из сигналов светорассеяния иизмерения времени пролета клеток череззону анализа, позволила исследователямсудить о морфологических характеристиках клеток(размере, отношении размеров ядра ицитоплазмы,гранулярности цитоплазмы, степениасимметрии клеток). В свою очередь, это привело квозможности типировать клетки безприменения флуоресцентных красителей, чтоособенно ценно при работе с периферическойкровью. Данный подход позволяет разделить ирасположить в виде гистограммы лейкоцитыпериферической крови на три группы клеток -лимфоциты, моноциты и гранулоциты (Bossuyt X. et al., 1997).

Развитие гибридомнойтехнологии привело к тому, что уисследователей появился в руках такой инструмент, какмоноклональные антитела. МА предоставили возможностьтипировать клетки не только благодаря ихморфологическим различиям, но и за счетнабора поверхностных антигенов ирецепторов, характерных для определенных клеток и ихфункционального состояния (Leucocyte typing VI., 1997). В настоящеевремя известно 339 кластеров дифференцировки (Cluster of Differentiation, CD) клетокчеловека(Zola H., et al., 2005).

Использование МАнапрямую меченых различными флуорохромамипозволилозначительно повысить информативностьцитометрического анализа за счет многоцветности.Поскольку современные цитометры, какправило, оборудованы более чем тремяфотоэлектронными умножителями (от 3 до 12ФЭУ), это позволяет на одном образцепериферической крови анализироватьпрактически все основные субпопуляции клеток.

Высокий уровеньавтоматизации, простота в эксплуатации,небольшие размеры современных приборов, ихвысокая точность, специфичность ивоспроизводимость результатов позволяютиспользовать их не только какисследовательские, но и как клинико-диагностические.

Перечисленныевозможности метода проточной цитометрииопределяют клинические и общебиологическиеобласти его применения. К первой относятся- иммунология, онкология, онкогематология(включая диагностику, оценку эффективностилечения имониторинг пациентов, входящих в группуриска), трансплантология, общая гематология идр. Ко второй - клеточная кинетика,клеточная энзимология, клеточная физиология,генетика идр.

Процесс развитияиммунного ответа организма напроникновение инфекции или какие-либодругие воздействия сопровождаетсязначительными изменениями субпопуляционного составаиммунокомпетентных клеток. Это относитсякак к изменению абсолютного количестваиммунокомпетентных клеток, ихсубпопуляционного состава, так и к появлениюна клеточной поверхности определенныхфункциональных молекул. Под воздействиемразличных агентов клетки приспосабливаются иотвечают на это изменением экспрессии техили иных мембранных и внутриклеточныхмаркеров.Таким образом, одним из эффективныхмеханизмов иммунорегуляции являетсямодуляция экспрессии функциональнозначимых молекул. В свою очередь, не менееважным является и изменение абсолютныхколичествиммунокомпетентных клеток в периферической крови.

Таблица 1.Среднестатистическое содержание основныхсубпопуляций лимфоцитов в периферическойкрови взрослых условно здоровых лицполученное врезультате скринингового исследования (N = 362).

Субпопуляции лимфоцитов

Относительные количества

Абсолютныеколичества(кл./л)

Лимфоциты(CD45bright)

32 ±4%*

1,363-2,808x 109

Т-клетки(CD3+,CD19-)

73 ±12%

0,946-2,079x 109

Тхелперы(CD3+,CD4+)

45 ±10%

0,576-1,336x 109

Т хелперыактивированные/памяти (CD3+,CD4+, CD45R0+, CD29+)

15 ±10%

0,068-0,702 x109

Т хелперынаивные (CD3+,CD4+,CD45RА+)

30 ±10%

0,272-1,123x 109

Тцитотоксические (CD3+,CD8+)

27 ±8%

0,372-0,974x 109

Т-клеткиактивированные (CD3+, HLA-DR+, CD25+, CD38+)

3 ± 3%

0,007-0,165 x109

Т-NK клетки (CD3+, CD16+, CD56+)

3 ± 3%

0,007-0,165x 109

В-клетки(CD3-, CD19+,CD20+,HLA-DR+)

12 ±5%

0,111-0,376 x109

NK-клетки (LGL) (CD3-, CD16+, CD56+, CD38±, CD8±)

13 ±5%

0,123-0,369x 109

Индекссоотношения CD4+/CD8+

1,5-2,6

*Относительные и абсолютные количествалимфоцитов определяли от общегоколичествалейкоцитов. Относительные и абсолютныеколичества субпопуляций Т-, В-, и NK-клеток определяли отобщегоколичества лимфоцитов.

Определениесубпопуляционного состава или фенотипалимфоцитов в настоящее время является важнымдиагностическим признаком, позволяющимсудить отечении процессов, происходящих ворганизме. Под фенотипом следует пониматьсовокупность функционально значимыхмаркеров, характерных для определенных стадийдифференцировки, пролиферации, активацииили программируемой клеточной гибели (апоптоза).Относительное и абсолютное количествоклеток, имеющих тот или иной фенотип, как раз иявляется конечным результатом иммунофенотипирования.

При подтвержденной ВИЧинфекции на «абсолютном содержании CD4+ Т-клеток в единицеобъема» построена система стадированиятечения заболевания, что является одним изосновных критериев назначенияантиретровирусной терапии.

Иммунофенотипированиепозволяет судить о типе клеток и ихфункциональном состоянии по наличию того илииного набора клеточных маркеров. В отличие отфлуоресцентной микроскопии, методпроточной цитометрии позволяет наиболееполно и наиболее корректно оценитьиммунофенотип пациентов.Иммунофенотипирование с использованиеммногоцветного анализа особенно важно дляхарактеристики высоко специализированных субпопуляцийлимфоцитов, таких как клеткииммунологической памяти,антиген-специфические и регуляторные Tклетки и субтипы NK-клеток.

Очень важным разделомдля биологии и медицины при появленииновых методик исследования являетсяформирование нормативных показателей. Неявляется исключением и проточнаяцитометрия. Проведенные исследования условноздоровых лицв различных регионах России сиспользованием скрининговой панелипозволилиопределить среднестатистические значенияпараметров иммунного статуса человека.Результаты, представленные в Таблице 1,свидетельствуют о близостисреднестатистических параметровиммунного статуса условно здоровых лиц кданным вотечественной и зарубежной литературе (Zidovec Lepej S., et al., 2003, Pope V., et al., 1994, Comans-Bitter W.M., et al., 1997).

Подходы кстандартизации метода проточнойцитометрии для иммунофенотипирования.Оптимизация настройки цитометров иподготовка протоколов для анализа.

Иммунофенотипирование позволяетохарактеризовать клетки при помощи МА и даетвозможность судить об их типе ифункциональном состоянии по наличию того или иногонабора клеточных маркеров. Однако следуетучитывать, что многие маркеры могутодновременно экспрессироваться наразличных типах клеток и определять их наличиеследует в режиме не менее чем двухцветногоанализа, а типирование лейкозов желательно проводитьв четырех- и более цветном анализе (Nagata H., et al., 2001; Claude L., et al., 2005).

В настоящее время всебольшее количествоклинико-диагностических лабораторий используютметод проточной цитометрии дляопределения иммунного статуса пациентов,диагностики лимфопролиферативныхзаболеваний и многих других важныхпараметров иммунной системы. Однако,отсутствие стандартных подходов к настройкецитометров, созданию протоколов дляисследования и подготовке образцов для анализа,по-прежнему делает метод проточнойцитометрии достаточно субъективным и, взначительной степени, зависимым от опытаоператора.

В процессецитометрического анализа могут бытьдопущены ошибки на разных этапах.Во-первых, цитометр должен находиться врабочем состоянии и проходить все тестыпроверки его работоспособности. Во-вторых,протоколы конкретного анализа должны бытьправильно настроены. Данная процедура независит оттипа прибора, поскольку процедурыподготовки инструментов для соответствующего анализаосуществляются практически по одному итому же алгоритму. В-третьих, на конечныйрезультат значительное влияние оказываетиспользование некачественныхреагентов или реагентов с истекшим срокомгодности. И, наконец, в-четвертых, на результатоказывают влияние ошибки, допущенные входе подготовки образца для анализа.

Одним из наиболееважных этапов при проведении стандартнойпроцедуры анализа фенотипа клеток ПКЧ являетсяправильность настройки протоколов дляконкретных типов анализа.

Данный этап состоит вследующем: настройка дискриминатора,настройка параметров светорассеяния,настройка параметров чувствительностифотоэлектронных умножителей (ФЭУ) дляфлюоресценции, введение коэффициентовкомпенсации.

Рис. 1. Примериспользования дискриминатора для удаленияиз зоны анализа частиц, не соответствующихклеткам по параметрам светорассеяния. А - анализобразца в отсутствии дискриминатора; Б -анализ образца при включенном дискриминаторе.

Оптимизация настройкидискриминатора.Современные цитометры обладают высокойчувствительностью по малоугловомусветорассеянию, т.е. по размерам исследуемыхчастиц (чувствительность достигает 0,1 мкм),поэтому они регистрируют множество объектов, которыене являются клетками. Особенно этопроявляетсяна образцах, приготовленных по такназываемой «безотмывочной» технологии. Наличие вобразце множества объектов, которые неявляются лейкоцитами, приводит к тому, чтоцитометр «захлебывается» от обилия данных иэто приводит к получению недостоверныхрезультатов. Чтобы избежать этого эффекта,необходимоввести ограничения по отображаемым нагистограмме событиям, т.е. задать границычувствительности цитометра. Для этих целейслужит дискриминатор. Необходимо ввеститакие его значения, чтобы были видны всеосновные популяции клеток анализируемогообразца, а частицы, которые не являютсяклетками (дебрис), не попадали в зону анализа.Как правило, это ограничение ставится наканал малоуглового рассеяния света (Рис. 1).Следует отметить, что слишком завышенные значениядискриминатора могут убрать из анализачасть интересующей исследователяпопуляции клеток, поэтому к этому этапунастройки цитометра необходимо подходить совсей ответственностью.

Оптимизация настройкипараметров светорассеяния.Как правило, современные цитометры используют дваканала светорассеяния: регистрируетсясигналы отмалоуглового светорассеяния и рассеяниясвета под углом 90о. Малоугловое светорассеяние(Forward Scatter, FS) представляетсобой рассеяние света от поверхности клетокпод малыми углами (1-19о) ипропорционально диаметру исследуемого объекта. Всвою очередь, канал боковогосветорассеяния или рассеяния света подуглом 90о(Side Scatter, SS) регистрируетвесь свет, рассеянный как самой клеткой, так иее органеллами, т.е. характеризуетструктуру и гранулярность объекта. Такимобразом, два вида светорассеяния позволяютрегистрировать два морфологических параметраклеток.

Рис. 2.Распределение клеток периферическойкрови при оптимальной настройке каналовсветорассеяния. FS –малоугловое светорассеяние; SS – светорассеяниепод углом90о.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»