WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |

Институтбиоорганической химии

имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Российской АкадемииНаук

На правах рукописи

ХАЙДУКОВ

Сергей Валерьевич

МНОГОЦВЕТНЫЙ АНАЛИЗ ВПРОТОЧНОЙЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХИССЛЕДОВАНИЙ

14.00.46 - клиническаялабораторная диагностика,

14.00.36 - аллергология ииммунология

Диссертация в виденаучного доклада на соискание ученой степени

доктора биологическихнаук

Санкт-Петербург -2008

Научныеконсультанты:

академик РАН, академикРАМН,

доктор медицинскихнаук, профессор ЧЕРЕШНЕВВалерий Александрович

доктор медицинскихнаук, профессор ЗУРОЧКААлександр Владимирович

Официальныеоппоненты:

доктор медицинскихнаук, профессор ТОТОЛЯН АрегАртемович

доктор биологическихнаук, профессор ПОЛЕВЩИКОВАлександр Витальевич

докторбиологических наук, профессор ЗЫБИНА НатальяНиколаевна

Ведущая организация:

ГОУ ДПО«Санкт-Петербургская медицинская академияпоследипломного образования Федеральногоагентства по здравоохранению исоциальному развитию».

Защита состоится«25» декабря 2008 г. в12.00 часов назаседании диссертационного совета Д 205.001.01 приФедеральном государственном учрежденииздравоохранения «Всероссийский центрэкстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России (194044,Санкт-Петербург, ул.Академика Лебедева, д. 4/2).

С диссертацией в виденаучного доклада можно ознакомиться вбиблиотеке Федерального государственногоучреждения здравоохранения«Всероссийскийцентр экстренной и радиационной медициныимени А.М.Никифорова» МЧС России

Диссертация в виденаучного доклада разослана «» 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

д.м.н. профессор С.С. Алексанин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальностьисследования. За последниегоды проточная цитометрия становится одним изнаиболее востребованных методов, как дляфундаментальных исследований, так и длядиагностики в клинико-иммунологическойпрактике. Расширилась приборная база, и значительноувеличились возможности анализа клетокиммунной системы, позволяющиеохарактеризовать не только качественные иколичественные параметры основныхпопуляций клеток, но и их более широкийсубпопуляционный состав. Используяразличные методологические подходы и новуюреагентную базу, при помощи проточнойцитометрии стало возможным оцениватьфункциональные свойства популяций исубпопуляций клеток иммунной системы.Значительно расширились возможности длядиагностики иммунодисфункций, аллергии,специфических Т-эффекторов и многое другое(Mandy F.F. et al, 2003; Boumiza R. et al., 2005; He X.H. et al., 2006).

Логика развитиясовременной технической, методологическойи идеологической базы проточнойцитометрии формируется на основе оченьшироких возможностей современныхприборов. Оснащенные гибким программнымобеспечением,они способны одновременно анализироватьколоссальное количество клеток,идентифицировать отдельные их группы,классы, популяции, субклассы, субпопуляциии т.д., измерять их поверхностные ивнутриклеточные маркеры, оценивать ихфункциональное состояние (Shapiro H.M. 2003).

Развитие современныхклеточных технологий и разнообразие новыхметодологических подходов кисследованиям, связанным с использованиемпроточной цитометрии в биологии имедицине, поставило целый ряд вопросов остандартизации данного метода. Эти вопросы особенноважны как для врачей лабораторнойдиагностики, так и для ученых испециалистов (Луговская С.А. и др., 2005; Gallego A. et al., 2003; Luider J. et al., 2004).

Столь высокоинформативный инструмент анализа создаетпредпосылки для появления множества новыхметодологических подходов для диагностикиразличных клеточных дисфункций. Например,уже сейчас 4-5 параметрический анализ позволяетвыявить не только ту или иную субпопуляциюклеток, но и ее функциональную активациюили депрессию. В то же время, если увеличитьанализ до 9-15параметровой системы оценки рецепторовклеток, появляется возможностьзначительно более углубленного анализа,который оправдан для научных исследований,но с точки зрения практической медицинытакой подход навряд ли применим, посколькусвязан со значительными методологическимитрудностями. Именно поэтому возникланеобходимость остановиться на техметодологических подходах, которыепозволяют по-новому взглянуть надинамическую систему взаимодействияклеток иммунной системы во всем ее разнообразии с четкойхарактеристикой субпопуляций клеток.

Цель работы. Обосновать методологию, критерии инаправления применения многоцветногоцитометрического анализа субпопуляцийлимфоцитов в медико-биологических исследованиях иоценить их эффективность.

Задачиисследований:

1. Разработать критерииприменения многоцветных параметров дляиммунофенотипирования клеток на основестандартизации протоколов исследований впроточной цитометрии.

2. Экспериментальнообосновать возможные пути применения ирасширения спектра исследований сиспользованием многоцветного анализа впроточной цитометрии.

3. Обосновать и оценитьэффективность применения многоцветногоанализа при изучении фенотипалимфоцитовдля лабораторной диагностики нарушенийиммунногостатуса человека.

4. На основе примененияцитометрического анализа разработатьалгоритм использования панелидля скрининговых исследований ирасширеннойпанели для более углубленного анализа привыявлении отдельных субпопуляцийлимфоцитов,параметры которых не попадают вреферентные значения.

5. Обосновать методологиюиспользования многоцветного анализа дляпроведенияуглубленных научных исследованийактивности субпопуляций лимфоцитов.

Научная новизнаисследований.

Впервые предложеналгоритм оптимизации работы на проточныхцитометрах от пре-аналитического,аналитического до пост-аналитическогоэтапов исследований, позволивший разработатькритерии стандартизации методовисследований. На их основе разработаныкритерии включения тех или иных параметровисследованийклеток для практического использования.

Экспериментальнообоснованы современные подходы красширению спектра исследований с учетомиспользования многоцветного анализа вклинической и научно-исследовательскойпрактике.

Обоснована возможностьоценки функциональной активности клетокиммуннойсистемы в процессе их дифференцировки привоздействии различных химических соединений(например, к действиюкальциевых ионофоров).

Предложена и внедренамногопараметрическая панельмоноклональных антител к различным кластерамдифференцировки, которая охватываетбольшинство лимфоцитов периферическойкрови и включает степень активацииразличных субпопуляций Т-клеток, В-клеток иNK-клеток, что позволяет более точнодиагностировать наиболее частовстречающиеся нарушения иммунной системы.Данная панельвключает:

IgG/IgG/IgG/CD45 - изотипическийконтроль

CD19/CD5/CD27/CD45 - В1, В2, В-клеткипамяти

CD16/CD56/CD3/CD45 - субпопуляции NK-клеток

CD8/CD4/CD3/CD45 - субпопуляцииТ-клеток

CD8/CD38/CD3/CD45 - активированныеТ-цитотоксические и NK-клетки

CD4/CD25/HLA-DR/CD45 - активированные Тхелперы

CD45RA/CD45R0/CD4/CD45 - активированные Тхелперы и Т-клетки памяти

TCR-/TCR-/CD3/CD45 - - и -Т-клетки

CD4/CD25/CD127/CD45 - регуляторныеТ-клетки.

Предложенные подходыпозволили повысить качество диагностикинарушенийиммунного статуса и значительно расшириливозможности исследования клеток иммуннойсистемы внорме и патологии.

Основные положения,выносимые на защиту:

  1. Разработанный алгоритмоптимизации настройки приборов и созданияпротоколовдля многопараметрического анализаприменим при работе на большинствепроточных цитометров ведущих фирмпроизводителей, и может быть использован длястандартизации исследований и разработкикритериев включения новых параметров исследования клетокиммунной системы.
  2. Среднестатистические значенияпараметров иммунного статуса условноздоровых лицв различных регионах России сопоставимы сосреднестатистическими значениямипараметров иммунного статуса человека,опубликованными в литературе.
  3. Введение в первичную панельскринигового исследования иммуннойсистемыантител для выявления аутореактивныхклонов В-клеток (CD19,CD5) улучшает диагностику имониторинг за пациентами с аутоиммуннымизаболеваниями.
  4. При наличии отдельных субпопуляцийлимфоцитов, параметры которых не попадают вреферентные значения в ходе скрининговыхисследований иммунной системы человека, необходимопроведение дополнительных исследований с оценкойнекоторых минорных субпопуляцийлимфоцитов и анализа функциональныххарактеристик клеток.
  5. В клинико-диагностической практикенаиболее предпочтителен четырехцветныйцитометрический анализ по сравнению сдвух- и трехцветным, что дает возможностьполучать достоверные данные,характеризующие как субпопуляционный состав, таки ряд функциональных параметровиммунокомпетентных клеток при уменьшенииколичества образцов и времени,затраченного на получение конечного результата.
  6. Изменение репертуараповерхностных рецепторов CD4+ Т-лимфоцитов впроцессеактивации и дифференцировкисопровождается резистентностью их кдействию кальциевых ионофоров.

Практическаязначимость работы.Разработанные подходы к стандартизацииисследований в проточной цитометрии,алгоритмы оптимизации исследованийотдельныхсубпопуляций и комплексной оценки клетокиммунной системы, предложенные в работе,позволяют применять полученные данные вповседневной практике клинико-диагностических инаучно-исследовательских лабораторий,оснащенных современными приборами.

Результатыисследований внедрены в учебный процессобучения врачей на курсе клиническойлабораторной диагностики ГОУ ВПОЧелябинской государственной медицинскойакадемии Росздрава, Санкт-ПетербургскийГосударственный Медицинский Университет им. академикаИ.П.Павлова; в работунаучно-исследовательских лабораторийИнститута биоорганической химии им. М.М.Шемякина иЮ.А. Овчинникова РАН (г. Москва), ГУ НИИфармакологии им. В.В. Закусова (г. Москва),Всероссийском Центре Экстренной иРадиационной Медицины им. А.Н.Никифорова, МЧС России(г. Санкт-Петербург), ММА им. И.М. Сеченова (г. Москва),Пятигорском ГНИИ курортологии, и рядедругих.

Апробацияработы. Материалыдиссертационной работы апробированы какна отечественных, так и на международныхсимпозиумах и конференциях: Первый Всесоюзныйиммунологический съезд (Сочи, 1989); 11th Meeting of European Federation of Immunological societies. (Espoo, Finland. 1991); 8th International Congress of Immunology, (Budapest,Hungary, 1992); 5thInternational Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, TissueAntigens (Boston, USA, 1993); 6th International Workshop and Conference on Human LeukocyteDifferentiation Antigens,Tissue Antigens, (Kobe, Japan, 1996); Fourth International Symposium onClinical Immunology (Amsterdam, Holland 1997); 10 International Congress ofImmunology (New Delhi,India, 1998); John HUMPHRY Advanced Summer Program in Immunology (Pushchino,1998, 2000, 2002, 2004); The 8th Annual Meeting of Tissue Engineering Society International,(Shanghai InternationalConventional, P.R. China, 2005); “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге” (Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001,2002, 2003, 2004, 2005, 2007); 2-я конференция “Иммунология репродукции” (Сочи, 2007); Симпозиум “Иммунология слизистых оболочек и аллергология: теория и практика” (Анталия,Турция, 2007);XX Зимняя международнаямолодежнаянаучная школа “Перспективныенаправленияфизико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, 2008).

Личный вклад автора вработу. Диссертационнаяработа является результатом многолетних(1986-2008 гг.) исследований по изучениюмеханизма функционирования иммуннойсистемы человека и животных при помощиметода проточной цитометрии и различных флуоресцентныхзондов. Все результаты получены личноавтором илипри его непосредственном участии. Доляличного участия в совместных публикацияхпропорциональна числу соавторов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 89работ, в том числе 3 монографии, 82 работы опубликованы врецензируемых журналах по перечню ВАК Министерства образования инауки Российской Федерации.

СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ.

Материалы и методыисследования.

Пациенты. При скрининговом исследованиииспользовали для анализа периферическую кровь 356условноздоровых лиц.

Для исследованиягомеостаза ионов кальция у CD4+ Т-лимфоцитов впроцессе их активации и дифференцировкиin vivoиспользовали кровь лиц, показатели иммунного статусакоторых соответствовали нормам дляздоровых людей. Было обследовано 112 человек.

Для оценки активности иколичества, различных субпопуляций клетокиммуннойсистемы было обследовано 214 человек сзаболеваниями, в основе которых лежат иммунныемеханизмы (аутоиммунный тиреоидит,ревматоидный артрит и др.).

Выделение клеточныхпопуляций и реагенты дляисследования. Фракцию мононуклеароввыделяли из венозной крови доноровцентрифугированием на Ficoll-Paque. Клеткиинкубировали с иономицином при 37° втечение 10 мин в среде Хенкса с 1% ФСК. После инкубации с иономициномклетки промывали ФСБ с 5% ФСК для удаленияСа2+-ионофора.Чувствительные и резистентные киономицинуТ-клетки разделяли на Ficoll-Paque (d = 1,077 г/см3).Чувствительные к иономицину клетки не сохранялижизнеспособность после обработкиионофором. Фракцию иономицин-резистентных(ИР-фракция) клеток собирали с поверхностиFicoll-Paque, окрашивали МА.

В работе использовалисреду Хенкса, брефелдин А, ФСК, ФСБ, ДМСО,ФМА, ConA, ФГА и культуральный пластик фирмы ICN (США),иономицин и гепарин (Calbiochem, Швейцария),Ficoll-Paque (Pharmacia, Швеция). Все используемые в работемоноклональные антитела (МА) получены отфирмы BeckmanCoulter(США).

Проточнаяцитофлуориметрия. Дляразработки алгоритма настройки цитометров, созданияпротоколов и последующего анализа былииспользованы контрольный материал ImmunoTrol, ImmunoTrol Low (Beckman-Coulter, США) и цельнаяпериферическая кровь, полученная отусловно здоровых лиц. Для окрашивания клетокиспользовали следующую панель МА меченыхFITC(изотиоцианатфлуоресцеина), PE (фикоэритрин), PC5 (комплекс PE с цианином-5),ECD (комплекс PE с техасскимкрасным) илиPC5 (комплексPE сцианином-7): CD4,CD5, CD8, CD14, CD19, CD25, CD26, CD27, CD29, CD38, CD45, CD45RA, CD45R0, CD62L, CD69, CD95 CD127, CD234, CD294, -TCR, -TCR, V1-TCR, V2-TCR, V14-TCR и HLA-DR (Beckman Coulter, США). Дляудаления эритроцитов пробоподготовкупроводили по безотмывочной технологии сиспользованием следующих лизирующихрастворов: OptiLyse C,OptiLyse B, ImmunoPrep и Whole Blood Lysing Reagents (Beckman Coulter,США).

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»