WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Определение содержания микроэлементов в мозге у крыс. В условиях обезболивания из полости черепа животных извлекался головной мозг для определения содержания в нем МЭ по методике Буреш Я. с соавт. (1991). Брались образцы тканей мозга из пяти областей: лобной, височной, теменной долей, мозжечка, промежуточного мозга и обонятельной луковицы. Образцы приготовлялись для мик­роволновой системы подготовки проб MD-2000 фирмы CEM (США) в соответствии со стандартным протоколом для данной системы. По­лученные растворы анализировались на масс-спектрометре с ионизацией в индук­тивно-связанной плазме «VG Plasma Quad PQ2 Turbo» (Англия). Этот метод признан наиболее точным и производительным. Он даёт возможность анализировать количественно почти все элементы, отражённые в таблице Д.И. Менделеева даже в следовых количествах.

Экспериментальное моделирование ишемии головного мозга. Ишемическое состояние головного мозга крыс достигалось посредством одномоментной двухсторонней окклюзии общих сонных артерий. Данный метод является наиболее простым способом моделирования ишемического повреждения ткани головного мозга у лабораторных животных. Метод широко используется в отечественных и зарубежных лабораториях. К достоинствам данного метода можно отнести несомненную простоту выполнения (Багметов М.Н., 2006). Хотя нельзя назвать эту модель глобальной ишемией мозга, при которой величина снижения мозгового кровотока должна быть в пределах 1-3% (Р.С. Мирзоян с соавт., 2005; Lipton P., 1999), избранная модель ишемии головного мозга позволяет оценить начальные дегенеративные изменения в ткани органа.

Определение пептидной фракции церебролизина. Для выделения и последующей очистки препарата от мембранной фракции и фосфолипидов использовался модифицированный метод Брокерхоффа-Даусона-Хюбшера – мягкое щелочное дезацилирование фосфолипидов (Кейтс М., 1975). Далее проводили обессоливание пептидов на мини-колонке при помощи центрифугирования (Дарбре А., 1989). Затем, проводили хромотографическое разделение компонентов церебролизин-2 на высокоэффективном жидкостном хромотографе Agilent 1100. Молекулярную массу пептидов и белков определяли методом MALDI-TOF (масс-спектрометр Bruker Reflex IV, 2002). Определение N-концевой аминокислотной последовательности проводили на приборе Protein/Peptide Sequencer (модель 477А, фирма «Applied Biosystems», США).

Исследование уровней металлотионеинов. Общую РНК, обогащенную иРНК, выделяли из ткани коры крыс одноэтапным методом (Chan, 1989) с помощью готовых для использования реагентов (RNA STAT-60, Tel Test B, Friendswood TX, USA), включавших фенол и гуанидин тиоцианат в монофазном растворе. Методику RT-PCR в реальном масштабе времени проводили по известной методике (Dixon, 2002) с помощью GeneAmp 5700 термосайклера (Applied Biosystems, USA) в соответствии с инструкциями производителя. ПЦР реакции проводили в трех повторах в 96-луночном планшете. Пороговую флюоресценцию во всех случаях определяли исходя из средней флюоресценции от всех образцов для циклов 3-15.

Статистическая обработка результатов. В работе использовались методы статистической обработки из пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. В основном, методы непараметрической статистики для сравнения нескольких независимых групп: непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса с последующим попарным сравнением групп по критерию Манна-Уитни, для зависимых групп; критерий Вилкоксона, для сравнения долей; критерий кси-квадрат для оценки связи двух показателей; критерий ранговой корреляции Спирмана. Для контроля результатов применялись аналогичные параметрические критерии – Стьюдента, Пирсона, однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующей проверкой различия средних по критериям Шеффе и Дункана.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение неврологического статуса экспериментальных животных. При моделировании двухсторонней хронической окклюзии общих сонных артерий у всех животных отмечались определенные изменения со стороны их неврологического статуса. У 3 крыс (7%) после перевязки артерий наступил летальный исход, 7 животных впали в коматозное состояние (17%), из них 1 животное погибло. Все 6 животных, находящихся в коме, вышли из этого состояния через 3-5 суток. У остальных крыс (76%) наблюдались неврологические изменения которые фиксировались на основе шкалы МсGrow.

После введения церебролизина проводилось наблюдение за животными с позиции выявления динамики их неврологического статуса, оценки двигательной активности, мышечной силы и исследовательского поведения. На 30 сутки у 31 крысы (~74%) отмечалась положительная динамика в отношении неврологического статуса. У животных в группах после лечения церебролизином была отмечена активизация движений, уменьшение птоза и полуптоза и пареза конечностей.

Очень заметно изменилась исследовательская активность животных после возникновения ишемического состояния головного мозга. До создания ишемии, все животные проявляли исследовательскую активность, которая после создания окклюзии сохранилась только у 8 (19%) животных. В течение 1 месяца терапии этот показатель у животных постепенно увеличивался и на 30 сутки был свойственен 23 животным (60,53%).

Проведение описанных тестов на 37 сутки эксперимента не дали каких- либо координальных изменений показателей, что свидетельствует, как можно предполагать, о том, что эффективность действия церебролизина максимально проявляется в 1 месяц.

Пептидная фракция церебролизина. В основе выполнения этого фрагмента работы был метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Возможности этого метода впервые позволили выявить трехмерное хроматографическое распределение компонентов церебролизина

(Рис.1).

Рис.1 Трехмерный спектр компонентов церебролизина (FPF-1070) фирмы «EBEVE» Австрия), на базе ВЭЖХ с использованием FLD детектора.

Разделение препарата свидетельствует о том, что церебролизин-2 содержит три группы соединений, которые условно можно обозначить как гидрофильные (время удержания (RT)<5 минут), нейтральные (RT от 5 до 20 минут) и липофильные (RT>20 минут).

Молекулярная масса пептидов церебролизина. Метод MALDI-TOF не позволяет определить количественное содержание пептидов. Однако, просматривается определенная закономерность: с увеличением номера фракции, растут молекулярные массы пептидов. По данным MALDI-TOF, церебролизин содержит множество различных типов пептидов. Анализ спектров молекулярных весов изученных образцов препарата свидетельствует об очень сложном многокомпонентном его составе. Подавляющее большинство пептидов имели молекулярную массу менее 7000 Да (Рис.2)

Рис.2 Верхний и средний спектры пептидной части препарата церебролизин-2

Сигналов выше 10 000 Да не обнаружено. При анализе кривой в целом можно сказать, что максимально устойчивые сигналы церебролизин дает в районе до 5000 Да. Менее устойчивые сигналы - в диапазоне 5000-7000 Да. Таким образом, проведенный анализ достоверно подтверждает наличие в церебролизине в основном легких пептидов с массой 2000-5000 Да (2552.3, 4215.5 и т.д.).

Сиквенс выделенных фракций пептидов. Исследования показали, что в очищенном церебролизине присутствуют более 100 олигопептидов и мотивов белков с массой в основном до 6000-7000 дальтон. При дальнейшем изучении состава препарата вновь была произведена еще более активная суперочистка и сгущение образцов для повторного сиквенса. Это позволило провести аккумуляцию основных пептидных пиков по молекулярным весам малыми шагами и установить наличие определенных пептидов. Основным результатом данной части исследования явилось нахождение в составе препарата следующих пептидов: тиролиберина (Glu-His-Pro), глутатиона (Gly-Cys-Glu), а также повторяющихся характерных сочетаний аминокислот (мотивов) коллагена (Gly-Pro-Hyp) и энкефалино-подобного пептида (Tyr-Gly-Gly-Phe).

В церебролизине идентифицирован трипептид тиролиберин с последовательностью аминокислот Glu-His-Pro, антагонист опиоидной активности. Основная функция олигопептида как антагониста опиоидной активности усиление выделения тиротропина передней долей гипофиза, а также стимуляция ростового гормона, кортикотропина (Гомазков О.А., 2001, Одинак М.М., Цыган Н.В., 2005; Monga V, 2008).

Из церебролизина выделен трипептид глутатион (аминокислотная последовательность Gly-Cys-Glu), который является одним из самых сильных биологических антиоксидантом. Глутатион – широко распространенный олигопептид организма человека, присутствет во всех тканевых образованиях, в надпочечниках, эритроцитах, цереброспинальной жидкости, мозге, хрусталике глаза. Наиболее важная функция – участие в окислительно-восстановительных реакциях; используется как восстановителя. Одна из важнейших функция глутатиона в организме – поддержка ключевых белков организма и аскорбиновой кислоты в восстановленном состоянии.

Выделенный пептидный мотив энкефалина с последовательностью аминокислот Tyr-Gly-Gly-Phе относится к пептидам с широким диапазоном действия в центральном и периферическом отделах нервной системы. Доказана способность энкефалинов вместе с другими пептидами регулировать болевую чувствительность, мотивацию удовлетворения, адаптационные процессы (Rohliff C., 2001). Энкефалиновый мотив при соединении с лейцином - это лейцин-энкефалин H- Tyr-Gly-Gly-Phе-Leu-OH, при соединении с метионином - метионин- энкефалин H- Tyr-Gly-Gly-Phе-Met-OH. Лейцин-энкефалин участвует в регуляции многочисленных соматических функций, в контроле поведенческих реакций (Громова О.А., 2004, Северин Е,С., 2005, Rohliff C., 2001). Оба этих пептида имеют высокое сродство с - и -рецепторами морфинового (опиоидного) типа. Многие пациенты получающие церебролизин, отмечают появление ярких цветных сновидений, косвенно свидетельствующие о воздействии эндорфинов и энкефалинов и их мотивов на кору головного мозга осуществляещееся, наиболее вероятно, через опиоидные рецепторы (Громова, Гупало, Торшин, 2008).

Обнаруженный в церебролизине устойчивый коллагено-подобный пептидный мотив Gly-Pro-Hyp может использоваться для реконструкции поврежденных и для синтеза новых опорных коллагеновых и других белков.

Жирнокислотный состав церебролизина. При определении жирокислотного состава методом газо-жидкостной хроматографии, позволившей получить хроматограмму церебролизина (рис.3).

Рис.3 Хроматограмма церебролизина.

В конечном итоге, в церебролизине и в стандарте были определены следующие жирные кислоты: миристоиловая, пальмитионовая, мальмитолеиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, арахидоновая. Их концентрация на единицу объема различна, что отражено в табл. 2.

Таблица 2

Жирнокислотный состав церебролизина.

Жирные кислоты, идентифицированные в церебролизине

и их концентрация при р <0,05.

Концентрация, мкг/мл образца (n=10)

Описание

1

20,5+2,14

Миристоиловая кислота (С:14:0)

2

25,0+1,21

Пальмитиновая кислота (С:16:0)

3

5,6+0,76

Пальмитолеиновая кислота (C:16:1)

4

45,0+0,13

Стеариновая кислота (C:18:0)

5

3,5+0,12

Олеиновая кислота (C:18:1)

6

1,5+0,09

Линолевая кислота (С:18:2)

7

1,1+0,06

Арахидоновая кислота (С:20:4)

Происхождение жирных кислот может быть обусловлено присутствием фосфолипидов или триглицеридов. Данные количества жирных кислот соответствуют примерно 150 мкг фосфолипидов или примерно 100 мкг триглицеридов в 1 мл препарата или их смеси. Логично предположить, что неиндентифицированные фракции соответствуют триглицеридам. Это предположение косвенно подтверждается данными газовой хроматографии, согласно которым в 1 мл церебролизина, как было определено, может содержаться до 100 мкг триглицеридов.

Максимальными значениями в фосфолипидном спектре церебролизина представлена стеариновая, C:18:0 (45,0 мкг/мл) и пальмитиновая кислоты, С:16:0 (25 мкг/мл). В значимых количествах в церебролизине обнаружена миристоиловая кислота (20,5 мкг/мл). Эта кислота участвует в сигнальном взаимодействии: изучается ее влияние на способность к связыванию ионов Са2+ с мембраной дисков сетчатки, где она удлиняет время жизни фотовозбужденного родопсина. Фосфолипидные мицеллы с гидрофобным миристоиловым фрагментом принимают участие в избирательном транспорте белков в мембранах комплекса Гольджи. Линолевая кислота присутствует в церебролизине в небольших количествах (3,5 мкг/мл); она предохраняет от окисления жирорастворимые витамины A, D, E и K, имеет транспортные роли.

Содержание фосфолипидов в церебролизине. Проведенное исследование показало, что в церебролизине при растворении его в ~0.6 мL фосфатном буфере содержится 12 мкМ фосфора в виде веществ, экстрагирующихся из препарата смесью метанол-хлороформ (1/2), что соответствует ~9,4 мкг фосфолипидов.

Фосфолипидный состав церебролизина, изученный методом тонкослойной хроматографии показал, что в экстракте из препарата церебролизин достоверно идентифицируются мозгоспецифичные фосфолипиды, относящиеся, в том числе, и к сфингомиелинанам: диацилфосфоэтаноламины (фосфатидилэтаноламины, кефалины), диацилфосфосерин (фосфатидилсерин, фосфосерин). Имеются следовые количества тристеарат глицерина, а также ряд неиндентифицированных фракций.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»