WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Карпова Евгения Константиновна

РОЛЬ ЭКДИСТЕРОИДОВ В РАЗВИТИИ СТРЕСС-РЕАКЦИИ И КОНТРОЛЕ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ DROSOPHILA В НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ УСЛОВИЯХ.

Генетика - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Новосибирск, 2008

Работа выполнена в лаборатории генетики стресса, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент,

Грунтенко Наталия Евгеньевна,

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Маркель Аркадий Львович,

кандидат биологических наук

Дубовский Иван Михайлович,

Ведущее учреждение:

Томский государственный университет, г. Томск

Защита диссертации состоится “____”____________ 2008 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д – 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (3832)33-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан “____”_______________ 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук А.Д. Груздев

Актуальность проблемы. Непрерывный рост социально-экологической напряженности на планете привлекает всё большее внимание исследователей к проблеме стресса. Эффективным способом защиты от неблагоприятных факторов среды является нейроэндокринная стресс-реакция, cвойственная всем представителям царства животных. Она позволяет им либо адаптироваться к неблагоприятным условиям, либо свести к минимуму повреждающее воздействие стрессора, если первое невозможно (обзоры: Jancovic-Hladni, 1991; Rauschenbach, 1991; Раушенбах, 1997; Грунтенко, Раушенбах, 2004). Таким образом, изучение адаптационных механизмов, обеспечивающих стресс-устойчивость, является одной из важнейших задач современной биологии.

Показано, что центральными звеньями стресс-реакции имаго насекомых являются биогенные амины, ювенильный гормон (ЮГ) и экдистероиды (Orchard et al., 1981; Davenport, Evans, 1984; Hirashima et al., 1993, 2000а,b; Rauschenbach et al., 1993, 1995; Раушенбах и др., 2000). Однако до сих пор остаётся неясным, существует ли компонент стресс-реакции (триггер), запускающий каскад изменений в остальных компонентах, или эти системы отвечают на неблагоприятные условия независимо друг от друга Ранее на роль триггера стресс-реакции были протестированы биогенные амины - дофамин (ДА) и октопамин (ОА), белки теплового шока, и ЮГ (Rauschenbach et al., 1993, 1995, 1996; Gruntenko et al., 1999, 2003b; Раушенбах и др., 2001). Однако, как оказалось, ни один из этих важнейших компонентов стресс-реакции не является пусковым.

Известно, что 20Э играет чрезвычайно важную роль в развитии, размножении и других жизненно важных функциях насекомых. Совместно с ЮГ он контролирует переход от одной онтогенетической стадии к другой: при высоком титре ЮГ происходит личиночно-личиночная линька, при снижении титра ЮГ и резком повышении содержания 20Э наступает метаморфоз, а в отсутствие ЮГ осуществляется линька в имаго (обзоры: Hammock, 1985; Zdarek, 1985; Riddiford, 1994). У имаго насекомых 20Э и ЮГ выполняют функции гонадотропинов: регулируют репродуктивную функцию самок Drosophila, инициируя синтез желточных белков (ЖБ) в жировом теле после вылета имаго, поддерживая затем его на определенном уровне и контролируя поглощение ЖБ ооцитами. Однако, до сих пор не существует единого мнения о вкладе каждого из этих гормонов в регуляцию репродуктивной функции насекомых (оогенеза, в частности).

В конце 1999 года Соллер с соавторами (Soller et al., 1999) на основании результатов экспериментов по обработке самок D. melanogaster экзогенными ЮГ и 20Э впервые выдвинули гипотезу о том, что для нормального течения оогенеза необходимо сохранение баланса 20Э и ЮГ. Результаты исследования влияния теплового стресса на оогенез D. virilis (Gruntenko et al., 2003а) дали подтверждение этой гипотезе и позволили авторам предположить что 20Э контролирует ранние, а ЮГ поздние стадии развития ооцитов дрозофилы.

Цель работы: Установить, какую роль играет 20-гидроксиэкдизон в развитии нейрогормональной стресс-реакции Drosophila и в контроле репродуктивной функции самок в условиях стресса.

Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать влияние мутации ecdysoneless1, нарушающей синтез 20-гидроксиэкдизона, на развитие стресс-реакции Drosophila и выяснить, является ли 20-гидрокиэкдизон запускающим звеном реакции.

2. Исследовать влияние пищевого стресса на оогенез и плодовитость линий D. virilis дикого типа и мутантной, с изменённым уровнем 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона.

3. Изучить воздействие экзогенных 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона на плодовитость D. virilis дикого типа в нормальных условиях и при пищевом стрессе.

4. Изучить механизм взаимодействия 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона в контроле репродуктивной функции Drosophila.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые проанализировано развитие стресс-реакции у самок линии ecd1, несущих рецессивную температурочувствительную мутацию ecdysoneless1 - она прерывает синтез 20Э при рестриктивной температуре. Установлено, что отсутствие 20Э не препятствует инициации стресс-реакции, хотя значительно изменяет ее интенсивность, т.е. 20Э является важным, но не пусковым звеном стресс-реакции дрозофилы.

Впервые обнаружено, что пищевой стресс вызывает у самок дрозофилы нарушения в ходе оогенеза: деградацию части ранних вителлогенических ооцитов, задержку их созревания и накопление зрелых ооцитов. Продемонстрировано, что эти изменения являются следствием изменений в метаболизме ЮГ и 20Э в ответ на действие стрессора, причем 20Э контролирует вителлогенические стадии оогенеза, а ЮГ – созревание и откладку яиц.

Впервые in vivo показано, что у самок дрозофилы существует механизм взаиморегуляции ЮГ и 20Э, опосредованной через систему метаболизма ДА.

Впервые установлено, что экспериментальное увеличение титра 20Э или ЮГ в нормальных условиях приводит к различным изменениям в репродуктивной функции самок дрозофилы: повышение титра 20Э снижает уровень плодовитости, не останавливая откладку яиц, а увеличение титра ЮГ вызывает прекращение откладки яиц, не влияя на уровень плодовитости.

Научно-практическая значимость работы. Результаты работы дают представление о структуре нейроэндокринного механизма, контролирующего приспособляемость насекомых к неблагоприятным условиям, которое может быть использовано для создания новых видов инсектицидов, безопасных для млекопитающих.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на IV Европейском симпозиуме по экофизиологии беспозвоночных (Санкт-Петербург, 2001), на конференции «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), на III Международной научной конференции молодых ученых (Алматы, Казахстан, 2003), на 18ой Европейской конференции по исследованиям на дрозофиле (Геттинген, Германия, 2003), на IV конференции молодых ученых, посвященной М.А. Лаврентьеву (Новосибирск, 2004), на III съезде ВОГИС (Москва, 2004), на VIII Международной конференции по ювенильному гормону (Кингз Бич, 2004), на XVI Международном симпозиуме по экдизону (Гент 2006), на XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на IX Международной конференции по ювенильным гормонам (Йорк, 2007) и на 2 Международном конгрессе по исследованию стресса (Будапешт, 2007).

Вклад автора. Основная часть экспериментов проведена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам лаборатории генетики стресса Института цитологии и генетики СО РАН Адоньевой Н.В., Фаддеевой Н.В., Ченцовой Н.А., Богомоловой Е.В, а также Сапрыкиной З.А. и доктору Иване Газиовой (Университет Южной Богемии, Чехия) за любезно предоставленную линию ecd1. Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н. Н.Е. Грунтенко и заведующей лабораторией д.б.н. И.Ю. Раушенбах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ (из них 7 статей).

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы, который состоит из 256 наименований. Работа изложена на 158 страницах, содержит 25 рисунков и 3 таблицы.

Материалы и методы

Материалы. Исследование проведено на двух моделях.

I. Линии Drosophila melanogaster: дикого типа – Canton S и линия ecdysoneless1, несущая рецессивную термочувствительную мутацию, прерывающую синтез 20Э при рестриктивной температуре (29оС)

II. Линии D. virilis, контрастные по реакции на действие теплового стресса: линия дикого типа 101 и линия 147, несущая мутации brick (розовые глаза), broken (прервана задняя поперечная жилка крыла) и detached (недоразвитие продольных жилок крыла) в хромосоме-2, температурочувствительную условную личиночную леталь в хромосоме-6.

Культуры линий выращивали на стандартной питательной среде (Раушенбах, Лукашина, 1984) при температуре 25оС и плотности 20 личинок на 7 мл среды. Синхронизацию культур проводили по вылуплению личинок и по вылету имаго.

Условия стрессирования. Мух стрессировали высокой температурой (38°С, экспозиция указана в соответствующих разделах) или голоданием (содержание на обедненной питательной среде: 20г агара и 4г сахарозы на 1л воды).

Биохимические методы. Содержание ДА измеряли флюориметрическим методом Майкеля (Maiсkel et al., 1968), модифицированным Кудрявцевой и Бакштановской (1989), измерение содержания 20Э проводили по методу Вайнрайта с соавторами (Wainwright et al., 1997), измерение деградации ЮГ проводили при помощи модифицированного (Rauschenbach et al., 1991) метода Хэммока и Спаркса (Hammock, Sparks, 1977).

Анализ плодовитости при голодании и экспериментальном изменении уровня 20Э осуществляли, как описано Раушенбах и др. (2005), при голодании и аппликации ЮГ - как описано Раушенбах и др (2004).

Приготовление препаратов яичников, окрашивание по Хечсту. Стадии развития ооцитов определяли в соответствии с King (1970), окрашивая яичники по Хечсту в модификации Cоллера с соавторами (Soller et al., 1999) и анализируя препараты с использованием флюоресцентного микроскопа Zeiss Axioskop 2 Plus (программное обеспечение Axio Vision).

Достоверность результатов оценивали, используя t-критерий Стьюдента.

Стресс-реактивность рассчитывали, как процент изменения признака у каждой стрессированной особи по отношению к среднему в контроле.

результаты и обсуждение

Роль 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона в регуляции оогенеза D. virilis в нормальных условиях и при голодании.

Ранее в лаборатории И.Ю. Раушенбах было показано, что тепловой стресс (38оС, 4 ч) вызывает у самок дикого типа (101) D. virilis накопление зрелых ооцитов, 24 ч задержку в откладке яиц, деградацию вителлогенических ооцитов и снижение плодовитости в течение нескольких суток; деградация ооцитов и снижение плодовитости наблюдались и у самок мутантной линии (147), однако накопления зрелых яиц и прекращения их откладки у мутантных самок зафиксировано не было (Rauschenbach et al., 1996; Gruntenko et al., 2003a). Исходя из этих результатов Грунтенко с соавторами (Gruntenko et al., 2003a) предположили, что деградация ранних вителлогенических ооцитов у D. virilis происходит под влиянием 20Э, титр которого возрастает у самок обеих линий (Раушенбах и др., 2000а; Gruntenko et al., 2003a); накопление же ооцитов на 14 стадии развития у самок дикого типа происходит в ответ на увеличение титра ЮГ при тепловом стрессировании, тогда как мутантные самки не накапливают зрелые яйца, так как их система метаболизма ЮГ не отвечает изменениями на тепловой стресс (Rauschenbach et al., 1995; Gruntenko et al., 2003a). Поскольку мутация 147 линии изначально была обнаружена, как температурочувствительная личиночная леталь (Raushenbach et al., 1984), можно было ожидать, что при стрессирующих воздействиях иной природы (например, при голодании), реакция системы метаболизма ЮГ у самок 147 линии окажется подобной той, которая наблюдается у самок дикого типа. Для проверки этого предположения мы исследовали ЮГ деградацию и оогенез у самок обеих линий под воздействием голодания.

Таблица 1. Динамика ЮГ-гидролизующей активности при голодании у самок Drosophila virilis дикого типа (101) и мутантов (147).

длительность голодания, ч

Гидролиз ювенильного гормона, пмоль/мин/муху

101

147

контроль

13,1±0,45

11,5±0,67

6

9,3±0,35

7,7±0,48

12

9,2±0,36

8,3±0,79

18

8,0±0,29

7,3±0,44

24

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»