WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 9 |

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедр факультетской терапии, патологической анатомии, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета, кафедры семейной медицины Ульяновского государственного университета. Практические рекомендации используются в работе ГУ «Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области», Волгоградского областного патологоанатомического бюро, ГУЗ «Волгоградское областное бюро СМЭ», Областном онкологическом центре Ульяновской области.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 305 страницах машинописного текста, содержит 87 таблиц, иллюстрирована 59 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Список литературы содержит 334 источника (211 на русском и 123 – на иностранных языках).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа носила экспериментальный характер и была выполнена с использованием 141 белых нелинейных крыс обоего пола (в том числе 21 – контрольные группы различных серий опытов). Протокол экспериментов составлен в соответствии с действующими нормативными документами в области биоэтики и правил лабораторной практики, программа экспериментов была согласована с Локальным независимым этическим комитетом по этической экспертизе диссертационных исследований (протокол № 18-2006 от 20 ноября 2006 года).

Использовали две модели хронического ЭТ: у 36 крыс с преимущественным поражением печени [Писарев В.Б. с соавт., 2002], у 36 - с преимущественным поражением почек [Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005]. Токсический гепатит и нефропатия в сочетании с печеночной и почечной недостаточностью воспроизводятся в этих моделях к 30 сут эксперимента, а к 90 сут удается воспроизводить более выраженные нарушения, связанные с формированием цирроза печени и нефросклероза.

Отдельная часть исследования была посвящена проведению патогенетической терапии, направленной на уменьшение тяжести хронического ЭТ путем целенаправленного изменения гормонального дисбаланса. Коррекция тиреостатическими препаратами осуществлялась с помощью препарата Тиамазол per os 24 крысам-самцам в дозе 20 мг/кг/сут в течение 5 дней и поддерживающей дозой 10 мг/кг массы животного 1 раз в 7 дней [Centero B.A., et al., 1996]. Гиперэстрогенемию вызывали 24 крысам-самкам путем внутримышечного введения 0,1% масляного раствора Эстрадиола из расчета 50 мкг/кг/сут в течение 7 дней с поддерживающей дозой 50 мг/кг массы животного 1 раз в 5 дней [Дедов И.И., с соавт., 2002.]

Морфологическим доказательством наличия хронического ЭТ являлись признаки прогрессирующего повреждения печени и почек с развитием в них компенсаторных процессов: хронического гепатита/гепато-фиброза и дисметаболической нефропатии/нефросклероза.

В качестве лабораторно-биохимических показателей ЭТ в плазме крови крыс определяли вещества средней молекулярной массы (ВСММ), олигопептидов [Малахова М.Я., 1995] и концентрацию продукта свободнорадикального окисления липидов - малонового диальдегида (МДА). В гомогенатах печени и почек определяли активность ацилазы, как маркера токсического повреждения [Фролов В.И. с соавт., 1991]. Эти исследования подтвердили, что во всех случаях у крыс развивалась хроническая эндогенная интоксикация (табл. 1).

Таблица 1

Биохимические показатели выраженности хронического ЭТ у крыс-самцов

(на примере модели с преимущественным поражением печени, M±m)

Показатели

Контрольная группа

Сроки эксперимента

30 сут

60 сут

90 сут

ВСММ, усл. ед.

Олигопептиды, мг/л

МДА, ммоль/л

Ацилаза печени, мккат/г белка

Ацилаза почек, мккат/г белка

0,16± 0,02

115,5 ± 13,8

5,33 ± 0,43

27,91 ± 1,93

35,61 ± 2,90

0,43 ± 0,05*

268,5 ± 29,8*

11,40 ± 0,94*

9,06 ± 0,87*

35,61 ± 2,90

0,49± 0,05*

289,4 ± 30,5*

10,53 ± 1,25*

7,58 ± 0,73*

18,21 ± 1,78*

0,51 ± 0,06*

291,0 ± 36,4*

11,08 ± 1,35*

5,97 ± 0,68*

13,61 ± 1,45*

Примечание. *Р<0,05 по сравнению с крысами контрольной группы

Поскольку течение и исход различных патологических процессов во многом определяются уровнем реактивности организма [Крыжановский Г.Н., 2001, 2004; Акмаев Г.Н., 2003], которая существенно зависит от пола, в сериях по исследованияю гонадной показатели развития хронического ЭТ раздельно проанализированы для крыс-самцов и самок. В последующем при сопоставлениях они выражались в процеснтах от соответствующих исходных величин.

Подготовку материала для патоморфологического исследования эндокринных органов - паравентрикулярного ядра гипоталамуса (PV), гипофиза, щитовидной железы (ЩЖ), надпочечников, яичников/семенников, поджелудочной железы проводили с помощью общепринятых методик [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996; Коржевский Д.Э., 2005].

Для прямого морфометрического исследования был использован компьютерный комплекс «Видеотест-Морфо» (Россия). Подсчитывали численную плотность и объемные доли (ОД) отдельных структур, показатели размеров и их соотношения [Автандилов Г.Г., 2002].

Степень повреждения эндокриноцитов оценивали по соотношению неизмененных клеток, эндокриноцитов, находящихся в состоянии повышенной функциональной секреции, крайнего истощения, повреждения или некроза (свыше 1000 клеток на одну железу). Результаты дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН [Новочадов В.В., 2005]. Он реализован в виде программного приложения «Radiana», позволяющий представить распределение яркости в радиальном и секторальном направлениях в единицах RGB виде матрицы данных MS Excel с расчетом коэффициентов этой функции.

Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием наборов антител фирмы «Novocactra Laboratories Ltd» (Великобритания);

- TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand, клон 27В12),

- каспаза-3 (Caspase-3, клон JHM62);

- эндотелиальная нитроксидсинтаза (NOS-3, клон RN5).

Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода. По степени экспрессии клетки относили к одному из классов: негативные, слабопозитивные, позитивные и гиперэкспрессирующие с выражением доли каждого класса в процентах [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004].

Для проведения ультрамикроскопического исследования животных подвергли эвтаназии путем внутривенной инфузии 4%-ного раствора параформа на 0,1 М какодилатном буфере (суправитальной фиксации) под нембуталовым наркозом. Дофиксацию производили в 4%-ном растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в 1%-ном растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (pH=7,4). Материал заливали в смесь эпона и аралдита, ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-8800. После контрастирования в 2,5%-ном растворе уранилацетата в течение 40 минут и 0,3%-ном растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронных микроскопе Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Фотодокументирование производили с использованием фотопленок «ФТ-40».

Для оценки функционального состояния органов эндокринной системы при хроническом ЭТ были определены концентрации гормонов в сыворотке крови с учетом наличия определенных эндокринных осей:

- адреналовой оси: АКТГ – кортизол.

- тиреоидной: ТТГ – Т3 и Т4 (общий и свободный), тиреоглобулин.

- гонадной: ФСГ, ЛГ, пролактин - тестостерон, эстрадиол, прогестерон.

- паравентрикуло-инсулярного пути: инсулин.

Исследование проводили методом ELISA с использованием спектрофотометра Stat Fax 2100 и вошера Stat Fax 2600 (AWARENESS Technology, USA) c помощью тест-систем «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия) и «DRG» (Germany).

Статистическая обработка проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами с помощью программных пакетов EXCEL 7.0 (Microsoft, USA) и АРКАДА (Диалог-МГУ, Россия). При регрессионном анализе выявлены наиболее значимые показатели, определение которых целесообразно для оценки влияния эндокринной дизрегуляции на выраженность изменений в данном органе при ЭТ [Платонов А.Е., 2000; Петри А., Сабин К., 2003; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологические изменения в паравентрикулярном ядре гипоталамуса крыс при хроническом эндотоксикозе.

Исследования PV при хроническом ЭТ были проведены нами совместно с В.И. Фроловым (2004). Полученные результаты выявили наличие однонаправленных изменений в моделях с преимущественным поражением печени и почек. В PV преобладали нейроны с вакуолизированной цитоплазмой, ядра нередко были деформированы и смещены к периферии клетки, в некоторых из них отсутствовали ядрышки. Среди сохранившихся нейронов выявлялись единичные клетки-тени, нейронофагия сочеталась с набуханием и частичной фрагментацией окружающих проводников, вблизи поперечных срезов полнокровных капилляров и венул отчетливо обнаруживались зоны периваскулярного отека.

В динамике ЭТ происходило уменьшение ОД нейронов, более выраженное в модели с преимущественным поражением печени (P<0,05). На 90-е сут эксперимента достоверно уменьшался средний размер ядер нейронов (примерно на 20% в обеих моделях). Выявленные изменения сопровождались увеличением коэффициента микроглия/нейрон. Полученные данные соответствуют полученным ранее доказательствам достаточно высокой чувствительности PV к разнообразным экзогенным повреждениям, что в первую очередь определяется функциональной нагруженностью ядра и слабостью его исходного микроглиального представительства [Писарев В.Б., 1990; Гуров Д.Ю., 2005; Потанин М.Б., 2008].

При исследовании распределения яркости методом радиальной морфометрии были выявлены четыре типа нейронов (рис. 1).

Рис. 1. Радиальная морфометрия нейронов паравентрикулярного ядра гипоталамуса. Четыре типа клеток в зависимости от характера функции радиального распределения яркости перикариона. По оси абсцисс относительное расстояние от границы ядра до внешней границы перикарина.

Нейроны I типа характеризовались монотонным нарастанием яркости от центра ядра к периферии с пиком яркости на 76-84% расстояния от ядра до плазмалеммы. Такие нейроны по всем остальным морфологическим признакам были отнесены к неповрежденным. Нейроны II типа отличались монотонным снижением яркости от ядра к периферии перикариона, пик яркости выявлялся на расстоянии 0-20% от границы ядра. Эти клетки соответствовали нейронам, находящимся в состоянии раздражения (функциональной стимуляции). Для нейронов III типа отличием от предыдущих являлось наличие «двугорбой» кривой. Пики яркости были расположены на расстоянии от ядра в пределах 41-75% и 86-94%. Такие нейроны имели все признаки истощения при гистологическом исследовании. Наконец, нейроны IV типа имели распределение яркости в виде обращенной параболы, с монотонным нарастанием и последующим снижением от центра ядра к периферии. Пик яркости располагался в пределах 50-75% расстояния от ядра до внешней границы перикариона. Эти клетки гистологически выглядели как грубо измененные нейроны и клетки-тени.

В PV животных контрольной группы были обнаружены нейроны II (42,6%), III (37,5%) и IV типов (19,9%). При ЭТ выявлено уменьшение в 1,8 раза нейронов III типа (P<0,001), увеличение нейронов IV типа (в 1,4 раза, P<0,05) и появление до 5% клеток I типа. Полученные данные явились дополнительным доказательством двунаправленности изменений нейронов PV при эндотоксикозе: наряду с появлением большого процента поврежденных и гибнущих клеток обнаруживаются нейроны с явлениями функциональной стимуляции и внутриклеточной перестройки.

Естественно, большинство изменений в PV гипоталамуса при хронических интоксикациях хорошо описаны и выглядят достаточно стереотипно [Туманов В.П., с соавт., 2003; Филатов В.В., Глумов В.Я., 2003; Писарев В.Б. с соавт., 2006; Евсеев В.А., 2007; Watanobe H., et al., 2003; Zhang W., 2003; Wu Y.H. et al., 2006; Doyon C. et al, 2007], но в рамках настоящего исследования они характеризуют тот морфологический субстрат центральных механизмов гормональной дизрегуляции, который участвует во всех последующих эндокринных изменениях при хроничексом ЭТ.

Морфофункциональные изменения гипофиза крыс при хроническом эндотоксикозе.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 9 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»