WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Испытание на токсичность проводили по ГФ XI (вып. 2, с. 182).

Стабильность субтилбена для определения срока его годности изучали методом «ускоренного старения» при повышенных температурах (37 и 50оС) и естественного хранения. Образцы экспериментальных серий препарата помещали в термостат на сроки, соответствующие 0,5; 1; 2 и 3 годам естественного хранения. Оценку качества препарата проводили по основным показателям.

Ветеринарно-санитарную экспертизу мяса осуществляли согласно ГОСТу 202353.

Для изучения профилактической эффективности субтилбен вводили перорально с водой или молоком в дозе 0,2; 0,3 и 0,5 г/кг массы тела один раз в сутки в течение 10 дней, лечебной – в тех же дозах 2 раза в сутки до выздоровления.

Экономическую эффективность научных разработок рассчитывали согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (утв. ГУВ МСХ СССР в 1982 г.), а также в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ, новой техники, изобретений и рационализаторских предложений» (утв. МСХ СССР в 1983 г.).

Методики отдельных экспериментов изложены в соответствующих разделах диссертации.

Цифровой материал диссертации обработан статистически по критерию Стьюдента для проверки достоверности различий. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при p0,05 (Лакин Г. Ф., 1990).

За основу выводов и практических предложений взяты результаты контролируемых опытов в лабораторных и производственных условиях.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Подбор штаммов B. subtilis и изучение их антагонистических свойств

Отбор производственных штаммов субтилбена производили из 5 штаммов B. subtilis, выделенных из ЖКТ новорожденных телят (BS TJ 06, BS TJ 07, BS TJ 08, BS TJ 09, BS TJ 10), и 2 штаммов из коллекции ТАУ (BS TJ Д 24, BS TJ Д 26).

В результате изучения морфологических свойств было установлено, что исследуемые культуры представляют собой грамположительные спорообразующие палочки с закругленными концами. Размер клеток – 1,90,5 нм; в мазках 18-часовой культуры клетки расположены одиночно, попарно, реже – в цепочку. Споры в клетке расположены центрально, размер спор – 0,90,5 нм.

На твердых питательных средах при температуре 37оС через 24 ч наблюдали рост бактерий в виде кремово-белых складчатых колоний с кратерообразным центром, вязкой консистенции, края колоний изрезанные.

Испытуемые культуры восстанавливали нитраты до нитритов, образовывали каталазу, кислоты из D-глюкозы, L-арабинозы, D-ксилозы и D-маннита, окисляли глюкозу с образованием ацетоина (ацетилметилкарбинола), расплавляли крахмал, желатин и казеин.

При пероральном и парентеральном введении смывов суточной агаровой культуры испытуемых штаммов B. subtilis белым мышам, кроликам и телятам в концентрациях 3 – 10 млрд м.к./гол. признаки заболевания и других физиологических отклонений у опытных (в сравнении с контрольными) животных не отмечали.

Результаты бактериологического исследования показали, что МПК 5 культур B. subtilis (BS TJ 08, BS TJ 09, BS TJ 10, BS TJ Д 24, BS TJ Д 26) составляет 3,9 – 15,6 млн м.к./мл. Две культуры (BS TJ 06; BS TJ 07) имели низкую антимикробную активность (рис. 1). Высокую противобактериальную активность (7,8 – 31,2) млн м.к./мл) проявили культуры BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 (рис. 2).

Полученные данные о морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных свойствах, патогенностости и противомикробной активности штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 послужили основанием для использования их при изготовлении субтилбена.

3.2. Разработка лекарственной формы субтилбена

3.2.1. Состав

Для успешной профилактики и лечения бактериальных желудочно-кишечных болезней необходима одновременная обработка большого поголовья, поэтому наиболее удобной и эффективной лекарственной формой является порошок для перорального применения.

В состав субтилбена входят:

взвесь м.к. штаммов B. subtilis BS TJ 09,

BS TJ Д 24, BS TJ Д 26 (1:1:1)

50 – 70 млрд м.к./г

минеральные и растительное вещества

остальное

3.2.2. Технология

Основные технологические стадии производства субтилбена в форме порошка следующие:

1. Получение матричных культур. С полужидкого агара культуру производственных штаммов B. subtilis засевают в пробирку с питательным бульоном СДБ и выращивают в течение 18 – 24 ч при 37оС. Культуры проверяют на чистоту и вновь засевают в матрасы, наполненные питательной средой не более 2/3 объема. Через 18 – 24 ч инкубирования культуры B. subtilis проверяют на чистоту и используют для изготовления производственной серии биомассы.

2. Изготовление производственной серии биомассы. Чистые культуры 18 – 24-часового роста в количестве 5%-ного объема засеваемой среды инокулируют в 10-литровые бутыли, наполненные средой СДБ (рН 7,4 – 7,6), и выращивают при 37оС в течение 48 ч. Затем культуры штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 B. subtilis смешивают в равных количествах. Полученный гомогенат перемешивают с бентонитопектиновой смесью.

3. Сушку производственной серии биомассы осуществляют методом контактно-сорбционного обезвоживания на бентонитопектиновой смеси в сушильном шкафу при 40 – 50оС в течение 48 – 72 ч. Концентрация биомассы культур B. subtilis в порошке – 50 – 70 млрд м.к. с содержанием 90 – 100% спор.

Рис. 1. МПК изученных штаммов, млн м.к. / мл.

Рис. 2. МБцК изученных штаммов, млн м.к. / мл.

3.3. Антагонистические свойства субтилбена

Борьба с инфекционными болезнями приобретает в последние годы все большее значение в связи с развитием резистентности микроорганизмов к широко применяемым антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам, что обусловливает необходимость изыскания эффективных лечебно-профилактических средств, в том числе биологических.

Изучение антагонистических свойств субтилбена в сравнительном аспекте (контроль – бактерин-SL) проводили методом двукратных серийных разведений в жидкой и плотной питательной средах на музейных штаммах (6) и изолятах E. coli (4), S. dublin (3), P. multocida (4), Pr. vulgaris (2), выделенных от больных диареей телят в животноводческих хозяйствах РТ.

При МПК в мазках тест-культуры, окрашенных по Граму, наблюдали задержку роста, МБцК (после пересева на агаровую или бульонную среды СБД) через 24 – 72 ч инкубации – гибель тест-микроба.

МПК субтилбена для E. coli и S. dublin – 7,8 млн м.к./мл, P. multocida и Pr. vulgaris – 15,6 (рис. 3), МБцК – соответственно 15,6; 31,2 млн м.к./мл (рис. 4), что свидетельствует о высокой бактериостатической и бактерицидной активности препарата в отношении исследованных тест-микробов.

Известный препарат бактерин-SL вызывал гибель тест-культур в концентрациях 125 (E. coli и P. multocida) и 250 млн м.к./мл (S. dublin и Pr. vulgaris).

Динамику антагонистической активности субтилбена изучили методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде в отношении односуточной бульонной культуры E. coli (концентрация – 1 млрд м.к./мл). Оценку бактерицидной активности проводили через 1, 3, 6, 12, 18, 24, 36 и 48 ч.

Установлено (рис. 5), что изменение морфологии E. coli начинается спустя 6 ч после контакта с препаратом: клетки тест-культуры увеличивались в размере и принимали различную форму. Через 12 – 18 ч количество клеток E. coli начинало уменьшаться, а через 48 ч после контакта с препаратом лизис тест-бактерий заканчивается.

При изучении динамики антагонистической активности субтилбена в отношении серотипов E. coli О8, О101 (выделялись наиболее часто), а также О9, О15, О55, О78, О117, О115, выделенных от больных колибактериозом телят, бактерицидная активность проявлялась в концентрациях 15,6 и 31,2 млн м.к./мл, что свидетельствует о равной активности препарата в отношении различных серотипов E. coli.

В контрольных пробирках (минеральные и растительное вещества) изменение морфологии тест-культуры не наблюдали, что свидетельствует о связи бактерицидной активности субтилбена с выделением B. subtilis биологически активных веществ.

Таким образом, субтилбен обладает высокой антагонистической активностью в отношении музейных штаммов и изолятов E. coli, S. dublin, P. multocida и Pr. vulgaris, которая обусловлена выделением B. subtilis биологически активных веществ.

Рис 3. Минимальная подавляющая концентрация, млн м.к./мл.

Рис 4. Минимальная бактерицидная концентрация, млн м.к./мл.

Рис. 5. Динамика лизиса E. coli после контакта с B. subtilis,

% лизиса.

3.4. Токсические свойства субтилбена

Безвредность субтилбена изучали на белых мышах (массой 18 – 20 г, n=10), кроликах породы шиншилла (массой 2,5 – 2,7 кг, n=5) и новорожденных телятах черно-пестрой породы (массой 31 – 33 кг, n=5), которым препарат в ориетировочно-терапевтической дозе (0,5 г/кг массы тела) вводили с водой перорально в объемах соответственно 0,5; 10 и 30 мл 2 раза в сутки в течение 7 дней.

В опытах на белых мышах (массой 18 – 20 г, n=10) и новорожденных телятах черно-пестрой породы (массой 31 – 33 кг, n=5), из которых по принципу парных аналогов сформировали по 11 групп, изучали острую токсичность субтилбена.

Белым мышам субтилбен в виде суспензии на физиологическом растворе вводили однократно перорально в объеме 0,5 мл в дозах 0,25 г/кг массы тела (1-я группа), 0,5 (2-я), 0,75 (3-я), 1,0 (4-я), 1,25 (5-я), 1,5 (6-я), 1,75 (7-я), 2,0 (8-я), 2,25 (9-я), 2,5 г/кг массы тела (10-я); телятам – в объеме 30 мл в тех же дозах. Контрольным животным в соответствующих объемах вводили физиологический раствор.

За лабораторными животными и телятами наблюдали в течение 14 дней, учитывая общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений.

Гибели опытных животных не наблюдали, клиническое состояние опытных и контрольных животных не отличалось.

Таким образом, субтилбен относится к малотоксичным веществам.

В опытах по скармливанию субтилбена в течение 20 суток трем группам (n=10) белых мышей (массой 18 – 20 г) и трем группам (n=10) кроликов породы шиншилла (массой 2,5 – 2,7 кг) в 2-, 5- и 10-кратной ориентировочно-терапевтической дозе (0,5 г/кг массы тела) изучали хроническую токсичность препарата. Животные контрольных групп субтилбен не получали. За лабораторными животными наблюдали в течение 30 дней.

Установлено, что длительное введение субтилбена в дозах 1,0; 2,5 и 5 г/кг массы тела не влияет на поведение, аппетит, прием воды, состояние слизистых оболочек и шерстного покрова опытных и контрольных животных.

Установлено, что применение субтилбена в дозах 1,0; 2,5 и 5 г/кг массы тела не влияет на динамику массы тела, которую определяли на 5, 10, 15 и 20 сутки, у опытных и контрольных животных (величины статистически не отличались). Применение препарата не вызывало повышения температуры тела и не влияло на характер локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость животных.

Влияние субтилбена на кожу и слизистые оболочки изучали методом однократной аппликации 10% суспензии субтилбена на кожу мышей (массой 18 – 20 г, n=6).

Повторное местное раздражающее действия препарата исследовали на белых мышах (самках, массой 18 – 20 г, n=6) и кроликах (самках, массой 2,5 – 2,7 кг, n=6), которым ежедневно на выстриженный участок кожи в межлопаточной области наносили соответственно по 1 и 2 капли субтилбена в течение 14 и 21 дня соответственно. Животным контрольных групп (n=6) по той же методике наносили подсолнечное масло. Наблюдение за белыми мышами вели в течение 30, кроликами –60 дней.

На кроликах (самках, массой 2,5 – 2,7 кг), которых разделили на две группы (n=6) изучали действие субтилбена на слизистую оболочку глаза.

Местное раздражающее действие субтилбена на кожу и слизистые глаз при однократном и повторном введении выражено слабо.

3.5. Стандартизация субтилбена

Для стандартизации и контроля качества субтилбена, изучения его стабильности при хранении нами разработаны качественные и количественные методы исследований, предусмотренные ОСТ 91500.05.001.00 в требованиях к качеству порошков.

Результаты проверки качества трех экспериментальных серий показали хорошую воспроизводимость и точность разработанных качественных и количественных методов контроля субтилбена.

Качество препарата характеризуется следующими физико-химическими и биологическими показателями:

1. Внешний вид и цвет – порошок серовато-белого цвета.

2. Наличие механических примесей, плесени – нет.

3. Концентрация водородных ионов (рН) 10% водной суспензии – 6,5 – 7,0.

4. Массовая доля влаги – не более 10%.

5. Однородность – посторонняя микрофлора отсутствует.

6. Количество м.к. B. subtilis – 50 – 70 млрд/г.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»