WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

4. Роль фактора элонгации EF1B в проявлении эффектов Ppz1p.

Антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1 связан с усилением фосфатазной активности Ppz1p, поскольку антисупрессия не наблюдается при сверхэкспрессии мутантной аллели ppz1-R451L, кодирующей каталитически неактивный Ppz1p. Очевидно, таким образом, что Ppz1p дефосфорилирует какой-то фофобелок, связанный с трансляцией. Этот белок в настоящее время неизвестен. A priori наиболее вероятным кандидатом на роль такого белка является фактор элонгации трансляции EF1B. В гене TEF5, кодирующем EF1B, изолирован ряд мутаций, приводящих к антисупрессии (Carr-Schmid et al., 1999). Кроме того, показано, что EF1B является мишенью фосфатазной активности Ppz1p и дефосфорилируется по остатку серина в положении 86. Мутация tef5-T622C, приводящая к замене серина на аланин, полностью блокирует фосфорилирование EF1B in vivo (de Nadal et al., 2001). Если EF1В действительно опосредует антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1, то этот эффект должен быть блокирован в штамме [PSI+], несущем эту мутантную аллель.

Для проверки этого предположения мы получили делецию гена TEF5 в штамме 5V-H19 [PSI+], содержащем центромерную плазмиду с мутантной аллелью tef5-T622C. В качестве контроля использовали изогенный штамм, экспрессирующий аллель дикого типа TEF5 с плазмиды. Фенотип этих штаммов свидетельствует о том, что tef5-T622C приводит к слабовыраженной антисупрессии по отношению к фактору [PSI+] (рисунок 8). Следовательно, уровень фосфорилированности EF1B по остатку Ser86 действительно влияет на эффективность нонсенс-супрессии, причем дефосфорилированное состояние EF1B ведет к антисупрессии. Эти данные подтверждают предположение о том, что антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1, по крайней мере частично, опосредован дефосфорилированием EF1B.

Рисунок 8. Мутация tef5-T622C приводит к антисупрессии на фоне [PSI+]. Символом TEF5wt обозначен исходный штамм 5V-H19 [PSI+], tef5-T622C - штамм 5V-H19-tef5 [PSI+], несущий плазмиду с аллелью tef5-T622C.

Далее штамм, экспрессирующий мутантную аллель tef5-T622C, трансформировали плазмидами, несущими аллели PPZ1 и ppz1-R451L. Фенотип трансформантов свидетельствует о том, что антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эффект ppz1-R451L проявляются на фоне tef5-T622C (рисунок 9). Это говорит о том, что EF1B является не единственной мишенью, опосредующей связь Ppz1p с трансляцией. По-видимому, проявление сверхпродукции Ppz1p также зависит от какого-то другого фосфобелка, связанного с трансляцией.

Рисунок 9. Эффекты PPZ1 и ppz1-R451L по отношению к фактору [PSI+] проявляются на фоне мутации tef5-T622C.

5. Поиск других белков-мишеней Ppz1p.

Мы показали, что EF1B играет минорную роль в проявлении эффекта сверхэкспрессии PPZ1. Поэтому мы рассмотрели ряд других фосфобелков, связанных с трансляцией, в качестве возможных мишеней Ppz1p. В их числе:

1. Фактор терминации трансляции eRF1 (Sup45p) - играет ключевую роль в считывании стоп-кодонов. Он фосфорилируется in vivo по Ser421 и Ser432 (Kallmeyer et al., 2006); фосфатаза, дефосфорилирующая Sup45p, в настоящее время неизвестна. Роль фосфорилирования Sup45p в клетке также не изучена.

2. Белки Upf1p (Nam7p) и Upf2p (Nmd2p) - необходимы для работы системы нонсенс-зависимой деградации мРНК (NMD). Кроме того, эти белки взаимодействуют in vivo с факторами терминации трансляции eRF1 и eRF3 (Czaplinski et al., 1998; Wang et al., 2001). Таким образом, эти белки тесно связаны с аппаратом трансляции и могут оказывать влияние на эффективность нонсенс-супрессии за счет как контроля активности системы NMD, так и регуляции считывания стоп-кодонов как значащих. Также известно, что Upf1p и Upf2p являются фосфобелками, причем фосфорилирование Upf2p необходимо для работы системы NMD (Wang et al., 2006). Фосфатаза, контролирующая уровень фосфорилированности Upf2p, в настоящее время неизвестна.

3. Фосфобелок Sla1p - взаимодействует in vivo как с Ppz1p (Venturi et al., 2000), так и с фактором терминации eRF3 (Bailleul et al., 1999). Делеция SLA1 приводит к повышению чувствительности к некоторым ингибиторам трансляции (Bailleul et al., 1999).

Для проверки возможной роли перечисленных фосфобелков в проявлении эффектов Ppz1p мы проанализировали проявление сверхэкспрессии PPZ1 и ppz1-R451L в производных штамма 5V-H19 на фоне:

а) Мутантной аллели sup45-S421/432A в штамме [PSI+], приводящей к заменам фосфорилируемых остатков серина в положениях 421 и 432 на аланин и вследствие этого кодирующей Sup45p, находящийся в конститутивно дефосфорилированном состоянии;

б) Одиночных делеций UPF1 и UPF2, а также двойной делеции этих генов в штаммах [psi-];

в) Делеции SLA1 в штамме [PSI+].

Во всех этих экспериментах мы наблюдали проявление антисупрессорного эффекта PPZ1 и аллосупрессорного эффекта ppz1-R451L (данные не представлены). Таким образом, белки Sup45p, Upf1/2p и Sla1p не участвуют в проявлении эффектов сверхпродукции Ppz1p (или их роль несущественна). Кроме того, проведенные эксперименты позволили также сделать следующие выводы:

1) Экспрессия мутантной аллели sup45-S421/432A не приводит к видимому изменению уровня нонсенс-супрессии в штамме [PSI+];

2) Эффекты сверхпродукции Ppz1p не связаны с изменением эффективности нонсенс-зависимой деградации мРНК;

3) Делеция гена SLA1 приводит к аллосупрессии по отношению к фактору [PSI+].

6. Роль Ssb1p и Ssb2p в проявлении аллосупрессорного эффекта ppz1-R451L.

Шапероны Ssb1p и Ssb2p также могут рассматриваться в качестве кандидатов на роль белков, участвующих в проявлении эффектов сверхпродукции Ppz1p. Гены SSB1 и SSB2 идентичны на 99%, поэтому Ssb1p и Ssb2p выполняют в клетке одни и те же функции. В отношении Ssb1p было показано, что он взаимодействует in vivo как с Ppz1p (Arino, 2002), так и с фактором терминации eRF3 (Allen et al., 2005). Кроме того, уровень экспрессии Ssb1p влияет на эффективность нонсенс-супрессии (Rakwalska a. Rospert, 2004; Hatin et al., 2007).

Мы получили одиночные делеции SSB1 и SSB2, а также двойную делецию этих генов в штамме 5V-H19 [PSI+]. Двойная делеция SSB1 и SSB2 приводит к аллосупрессии по отношению к [PSI+], в то время как одиночные делеции не оказывают видимого влияния на фенотип штамма; эти данные свидетельствуют о перекрывании функций белков Ssb1p и Ssb2p в регуляции эффективности нонсенс-супрессии. Далее штаммы с делециями трансформировали плазмидами, несущими аллели гена PPZ1. Антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1 проявляется во всех проанализированных штаммах (рисунок 10). Следовательно, Ssb1p и Ssb2p не принимают участия в проявлении сверхэкспрессии аллели дикого типа PPZ1.

Тем не менее, аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии ppz1-R451L проявляется на фоне одиночных делеций SSB1 или SSB2, но не на фоне двойной делеции этих генов. Таким образом, для проявления мутантной аллели ppz1-R451L необходимо наличие хотя бы одного из белков Ssb.

Эти данные позволяют предположить, что антисупрессорный эффект аллели дикого типа PPZ1 и аллосупрессорный эффект мутантной аллели ppz1-R451L обусловлены различными механизмами. Механизм, обеспечивающий проявление мутантной аллели ppz1-R451L, зависит от экспрессии генов SSB1 и SSB2, в то время как проявление аллели дикого типа PPZ1 Ssb-независимо.

Рисунок 10. Аллосупрессорный эффект ppz1-R451L по отношению к [PSI+] проявляется в исходном штамме 5V-H19 (обозначен как SSB1/2wt), но не в штамме 5V-H19-ssb1/2 (обозначен как ssb1/2).

Ssb-зависимый аллосупрессорный эффект мутантной аллели ppz1-R451L может быть объяснен следующим образом:

Мы показали, что двойная делеция SSB1 и SSB2 в штамме [PSI+] приводит к увеличению эффективности нонсенс-супрессии. Иными словами, уменьшение количества молекул Ssb1p и Ssb2p, взаимодействующих с компонентами аппарата трансляции, имеет нонсенс-супрессорный эффект. По-видимому, при сверхпродукции каталитически неактивной формы Ppz1p возрастает доля молекул Ssb1p и Ssb2p, взаимодействующих in vivo с Ppz1p, что приводит к снижению пула молекул этих шаперонов, взаимодействующих с рибосомой и с факторами терминации трансляции и, следовательно, к нонсенс-супрессии (рисунок 11).

Рисунок 11. Влияние Ppz1p на эффективность нонсенс-супрессии может быть обусловлено двумя различными механизмами.

В таком случае, при сверхэкспрессии аллели дикого типа PPZ1 можно предположить, что аллосупрессорный эффект, обусловленный взаимодействием между Ppz1p и белками Ssb, маскируется более сильным антисупрессорным эффектом, обусловленным увеличением фосфатазной активности Ppz1p (см. рисунок 11). Эта фосфатаза дефосфорилирует как минимум два белка: фактор элонгации EF1B, а также какой-то другой белок, в настоящее время остающийся неизвестным.

ВЫВОДЫ

1) Эффективность нонсенс-супрессии, обусловленной мутациями в генах SUP35 и SUP45, а также дрожжевым прионом [PSI+], зависит от активности фосфатазы Ppz1p;

2) Сверхпродукция каталитически активной формы Ppz1p обладает антисупрессорным эффектом, а сверхпродукция мутантного белка, лишенного фосфатазной активности, проявляет аллосупрессорный эффект;

3) Показано, что родственная Ppz1p фосфатаза Ppz2p также вовлечена в детерминацию эффективности нонсенс-супрессии; при этом ее активность регулируется общей с Ppz1 регуляторной субъединицей Hal3p;

4) Модификация фенотипического проявления фактора [PSI+] в зависимости от активности Ppz1p не связана с влиянием этой фосфатазы на прионное превращение белка Sup35p;

5) Уровень фосфорилированности фактора элонгации трансляции EF1B влияет на фенотипическое проявление фактора [PSI+] (хотя и в незначительной степени), но не влияет на проявление эффектов сверхпродукции нормальной и мутантной формы фосфатазы Ppz1p;

6) Эффективность нонсенс-супрессии в штамме [PSI+] не зависит от уровня фосфорилированности фактора терминации eRF1;

7) Влияние фосфатазы Ppz1p на эффективность нонсенс-супрессии не связано с активностью компонентов системы нонсенс-зависимой деградации мРНК;

8) Делеция гена SLA1 характеризуется аллосупрессорным эффектом по отношению к фактору [PSI+], но не влияет на проявление эффектов сверхпродукции нормальной и каталитически неактивной форм Рpz1p;

9) Аллосупрессорный эффект каталитически неактивной формы Ppz1p по отношению к фактору [PSI+] может быть объяснен ее взаимодействием с шаперонами Ssb1p и Ssb2p.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Рогоза Т.М., Викторовская О.В., Родионова С.А., Иванов М.С., Волков К.В., Миронова Л.Н. Поиск генов, влияющих на поддержание антисупрессорного прионоподобного детерминанта [ISP+] у дрожжей, с помощью инсерционной библиотеки генов // Молекулярная биология. 2009. Т. 43. № 3. С. 1-8.

2) Иванов М.С., Аксенова А.Ю., Бурдаева Я.В., Радченко Э.А., Миронова Л.Н. Сверхэкспрессия гена PPZ1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae влияет на эффективность нонсенс-супрессии // Генетика. 2008. Т. 44. № 2. С. 177-184.

3) Rogoza T., Goginashvili A., Ivanov M., Mironova L. Nonsense Suppression Efficiency is Yeasts Depends on the Level of SFP1 Expression. CSHL Meeting on Translational Control (Cold Spring Harbor, USA, September 3-7, 2008) - Book of Abstracts, P. 277.

4) Ivanov M.S., Radchenko E.A., Mironova L.N. Phosphatase Ppz1p influences the efficiency of nonsense suppression by pathways distinct from the dephosphorylation of the elongation factor EF1B in yeast Saccharomyces cerevisiae. 12th International Congress on Yeasts (Kyiv, Ukraine, August 11-15, 2008) - Book of Abstracts, P. 145.

5) Ivanov M.S., Aksenova A.Yu., Radchenko E.A. and Mironova L.N. The level of Ser/Thr phosphatase Ppz1p influences the manifestation of certain mutations in SUP35 and SUP45 genes as well as [PSI+] prion in Saccharomyces cerevisiae. EuroPhosphatases 2007 "Protein Phosphatases in Health and Disease" (Aveiro, Portugal, July 24-28, 2007) - Book of Abstracts, P. 183.

6) Ivanov M.S., Aksenova A.Yu., Mironova L.N. Influence of Ser/Thr phosphatase Ppz1p on manifestation and propagation of [PSI+] prion in Saccharomyces cerevisiae // III International Young Scientists Conference (Odesa, Ukraine, May 15-18, 2007) – Book of Abstracts, P. 192.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»