WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Методы. Использовали стандартные методы генетики дрожжей (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986) и стандартные среды: YAPD, полную синтетическую среду SMM, а также селективные среды, не содержащие отдельных компонентов среды SMM. Кроме того, использовали среды на основе YAPD, содержащие гигромицин Б (HygB) либо генетицин (G418), а также среду на основе SMM, содержащую 5-фтороротовую кислоту.

Качественную оценку эффективности нонсенс-супрессии осуществляли визуально по росту штаммов на средах SMM-Ade (в случае супрессии ade1-14 и ade2-1), SMM-His (his7-1) и SMM-Trp (trp1-289). Для этого производили упорядоченный посев суспензии дрожжевых клеток (в серии последовательных разведений в 3 раза) на соответствующую селективную среду (см. Hampsey, 1997). Использование последовательных разведений повышало разрешающую способность метода и позволяло регистрировать даже незначительные отличия в эффективности нонсенс-супрессии.

ПЦР, рестрикционный анализ, выделение геномной и плазмидной ДНК, трансформацию дрожжей и E.coli, гель-электрофорез ДНК, иммуноблоттинг проводили в соответствии со стандартными методиками (Sambrook et al., 1989; Kaiser et al., 1994; Gietz et al., 1992; Inoue et al., 1990). Электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) осуществляли по модифицированной методике (Kushnirov et al., 2006). Получение мутантной аллели tef5-T622C проводили методом Overlap Extension PCR (Pont-Kingdon, 2003). Делеции генов TEF5, SUP45, SLA1, SSB1, SSB2, UPF1, UPF2, HAL3, PPZ1 и PPZ2 были получены с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов (Wach et al., 1994; Goldstein a. McCusker, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сверхпродукция Ppz1p влияет на проявление некоторых мутаций в генах sup35 и sup45, а также дрожжевого приона [PSI+].

Мутации в генах SUP35 и SUP45, кодирующих факторы терминации трансляции eRF3 и eRF1, соответственно, приводят к нарушению точности трансляции; в их присутствии повышается уровень считывания стоп-кодонов как значащих. Эпигенетический фактор [PSI+] представляет собой продукт прионного превращения Sup35p; в его присутствии уменьшается доля мономеров Sup35p, участвующих в терминации трансляции, что также приводит к увеличению эффективности нонсенс-супрессии.

Ранее влияние сверхэкспрессии гена PPZ1 на уровень нонсенс-супрессии было показано в штамме, несущем нонсенс-мутацию sup35-25, а также криптическую мутацию sup45-400 (Aksenova et al., 2007). Поэтому было необходимо выяснить, являются ли эффекты PPZ1 специфичными по отношению к этим мутациям, или они могут проявляться и на фоне других нонсенс-супрессорных факторов.

В первую очередь мы проанализировали влияние сверхэкспрессии PPZ1 на проявление 8-ми различных мутаций в гене SUP45 в отсутствие мутаций sup35. Использованные мутантные аллели sup45 различаются по молекулярной природе (среди них есть как миссенс-, так и нонсенс-мутации) (см. таблицу 2), а также по эффективности нонсенс-супрессии (рисунок 1).

У штамма 1А-Д1628, несущего делецию хромосомной копии гена SUP45 и плазмиду с геном SUP45, методом плазмидного шафлинга заменяли эту компенсирующую плазмиду на плазмиды, содержащие мутантные аллели sup45. Далее этих трансформантов дополнительно трансформировали плазмидами YEplac195-PPZ1 и YEplac195-PPZ1-R451L, несущими аллель дикого типа PPZ1 и мутантную аллель ppz1-R451L, а также контрольной плазмидой YEplac195. Мутация ppz1-R451L полностью блокирует каталитическую активность Ppz1p (de Nadal et al., 2001).

Рисунок 1. Производные штамма 1А-Д1628, несущие различные мутации sup45 на плазмиде, различаются по эффективности нонсенс-супрессии. Символом wt обозначена аллель дикого типа SUP45, номерами 101 - 116 обозначены мутации sup45-101 - sup45-116. На этом и последующих рисунках символом SMM обозначена синтетическая питательная среда, обеспечивающая рост используемого штамма и поддержание плазмид, SMM-Ade - среда на основе SMM, не содержащая аденина, SMM-Trp - не содержащая триптофана.

Мы обнаружили, что сверхэкспрессия PPZ1 ослабляет супрессорный эффект пяти из восьми проанализированных мутаций (sup45-101, -104, -111, -115 и -116). В то же время сверхэкспрессия ppz1-R451L усиливает супрессорный эффект этих пяти мутаций. В то же время сверхэкспрессия PPZ1 и ppz1-R451L существенно (по крайней мере, в пределах разрешающей способности метода) не изменяет проявление трех других мутаций (sup45-103, -105 и -107) (рисунок 2). Таким образом, проявление мутаций sup45 может зависеть от уровня экспрессии фосфатазы Ppz1p.

Рисунок 2. Антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эфффект ppz1-R451L проявляются на фоне sup45-116 (А), но не на фоне sup45-105 (Б). На этом и последующих рисунках символом обозначен контрольный вектор YEplac195, PPZ1 - плазмида YEplac195-PPZ1, ppz1-R451L - плазмида YEplac195-PPZ1-R451L.

Далее мы проанализировали влияние сверхэкспрессии гена PPZ1 на проявление пяти нонсенс-мутаций, а также двух миссенс-мутаций в гене sup35 (см. таблицу 2). Экспрессия всех использованных мутантных аллелей sup35 приводит к выраженной нонсенс-супрессии (Chabelskaya et al., 2004). Как и в предыдущем эксперименте, у штаммов, содержащих делецию хромосомной копии гена SUP35 и плазмиду, компенсирующую летальный эффект делеции, методом плазмидного шафлинга заменяли компенсирующие плазмиды на плазмиды, несущие мутантные аллели sup35. Далее полученные штаммы дополнительно трансформировали мультикопийными плазмидами, несущими аллели гена PPZ1. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия PPZ1 и ppz1-R451L не влияет на проявление всех пяти нонсенс-мутаций sup35, а также обеих миссенс-мутаций sup35-10 и sup35-25 (данные не представлены).

Вместе с тем, необходимо отметить, что ранее антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1 был показан в штамме, несущем одну из проанализированных мутаций - sup35-25 (Aksenova et al., 2007). Однако, этот штамм содержал криптическую мутацию sup45-400. Поэтому можно предположить, что для проявления эффектов PPZ1 на фоне мутаций sup35 могут быть необходимы мутации sup45. С другой стороны, проявление эффектов PPZ1 может зависеть от эффективности нонсенс-супрессии, обуславливаемой мутациями sup35.

Для проверки этих предположений мы проанализировали проявление сверхэкспрессии PPZ1 и ppz1-R451L в штамме 21А-Д863 на фоне "укороченных" аллелей sup35-10С и sup35-25С, кодирующих только С-терминальный домен Sup35p. Ранее было показано, что эти аллели характеризуются как минимум в два раза меньшей эффективностью нонсенс-супрессии по сравнению с полноразмерными аллелями sup35-10 и sup35-25 (Volkov et al., 2007). Мы обнаружили, что антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эффект ppz1-R451L, действительно, наблюдаются на фоне "укороченных" аллелей sup35-10C и sup35-25C (рисунок 3). Таким образом, эффекты сверхпродукции Ppz1p могут проявляться на фоне мутантных аллелей sup35 в отсутствии дополнительных мутаций sup45. При этом проявление эффектов PPZ1 зависит от уровня нонсенс-супрессии, обусловленной мутантными аллелями sup35.

Рисунок 3. Антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эффект ppz1-R451L наблюдаются на фоне "укороченной" мутантной аллели sup35-25C. Символом SMM-His обозначена среда на основе SMM, не содержащая гистидина, SMM-Lys - не содержащая лизина.

Являются ли мутации sup35 и sup45 необходимым условием для проявления эффектов сверхпродукции Ppz1p, или же эти эффекты могут проявляться при снижении эффективности терминации трансляции, обусловленной другими причинами Для ответа на этот вопрос мы проверили возможный эффект сверхэкспрессии PPZ1 и ppz1-R451L в штамме 5V-H19 [PSI+], не содержащем мутаций sup35 и sup45. Антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эффект мутантной аллели ppz1-R451L проявляются на фоне нонсенс-супрессии, обусловленной фактором [PSI+] (рисунок 4). Таким образом, проявление эффектов PPZ1 может наблюдаться и в отсутствии мутаций sup35 или sup45. Это говорит о том, что эффекты PPZ1 проявляются на фоне нонсенс-супрессии, которая может быть обусловлена факторами различной природы.

Рисунок 4. Сверхэкспрессия PPZ1 приводит к антисупрессии, а сверхэкспрессия ppz1-R451L - к аллосупрессии по отношению к фактору [PSI+] в штамме 5V-H19.

Изменение фенотипического проявления фактора [PSI+] при сверхэкспрессии PPZ1 может быть связано с зависимостью прионного превращения Sup35p от фосфатазной активности Ppz1p. Для проверки этого предположения мы проанализировали количество Sup35р, находящегося в мономерной фракции, по сравнению с количеством тотального белка Sup35p в штаммах [PSI+] на фоне сверхэкспрессии PPZ1 и ppz1-R451L. Мы обнаружили, что распределение Sup35p между полимерной и мономерной фракциями не изменяется при сверхэкспрессии аллелей гена PPZ1 (данные не представлены). Таким образом, сверхпродукция Ppz1p не влияет на прионное превращение белка Sup35p. Эти данные косвенно свидетельствуют об отсутствии непосредственного взаимодействия между фосфатазой Ppz1p и фактором терминации eRF3.

2. Сверхэкспрессия и делеция HAL3 влияют на проявление фактора [PSI+].

На предыдущем этапе работы мы показали, что сверхпродукция Ppz1p влияет на проявление некоторых мутаций sup35 и sup45, а также фактора [PSI+]. Известно, что белок Hal3p является негативной регуляторной субъединицей фосфатазы Ppz1p (de Nadal et al., 1998). В таком случае следует ожидать, что изменение уровня экспрессии HAL3 может влиять на уровень нонсенс-супрессии за счет изменения фосфатазной активности Ppz1p. Для проверки этого предположения мы проанализировали эффекты делеции и сверхэкспрессии гена HAL3 в штамме 5V-H19 [PSI+]. Мы показали, что делеция HAL3 приводит к антисупрессии, а сверхэкспрессия HAL3 - наоборот, к аллосупрессии по отношению к фактору [PSI+] (рисунок 5). Таким образом, проявление фактора [PSI+] зависит от уровня экспрессии гена HAL3.

Рисунок 5. Делеция HAL3 (А) приводит к антисупрессии, а сверхэкспрессия HAL3 (Б) - к аллосупрессии в штамме 5V-H19 [PSI+]. Символом wt обозначен исходный штамм 5V-H19 [PSI+], hal3 - штамм 5V-H19-hal3 [PSI+], HAL3 - плазмида YEplac195-HAL3.

3. Сверхэкспрессия HAL3 проявляется на фоне делеции PPZ1, но не двойной делеции PPZ1 и PPZ2.

Поскольку Hal3p является негативным регулятором Ppz1p (de Nadal et al., 2001), то можно предположить, что аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии HAL3 обусловлен снижением фосфатазной активности Ppz1p. В таком случае следует ожидать, что проявление сверхэкспрессии HAL3 будет блокировано в штамме, несущем делецию PPZ1. Для проверки этого предположения мы получили делецию гена PPZ1 в штамме 5V-H19 [PSI+]. Как и следовало ожидать, эффект делеции PPZ1 противоположен эффекту сверхэкспрессии этого гена, т.е. он проявлятся как аллосупрессия по отношению к [PSI+] (рисунок 6). Далее штамм 5V-H19-ppz1 [PSI+] трансформировали мультикопийной плазмидой YEplac195-HAL3, несущей гена HAL3. Как оказалось, аллосупрессорный эффект сверхпродукции Hal3p проявляется на фоне делеции гена PPZ1 (рисунок 7). Следовательно, влияние HAL3 на эффективность нонсенс-супрессии не может быть объяснено только ингибированием Ppz1p. Скорее всего, в этом процессе участвуют и другие белки, связанные с трансляцией.

Наиболее вероятным кандидатом на роль такого белка является фосфатаза Ppz2p. Показано, что Hal3p и Ppz2p взаимодействуют in vivo (Tarassov et al., 2008). Кроме того, Ppz1p и Ppz2p высокогомологичны, поэтому можно предположить, что Hal3p является общей регуляторной субъединицей как Ppz1p, так и Ppz2p. В таком случае аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии HAL3 должен быть блокирован на фоне двойной делеции PPZ1 и PPZ2, но не на фоне одиночной делеции PPZ2.

Для проверки этого предположения мы получили делецию PPZ2, а также двойную делецию PPZ1 и PPZ2 в штамме 5V-H19 [PSI+]. Мы показали, что делеция PPZ2 приводит к аллосупрессии по отношению к [PSI+]; таким образом, фосфатаза Ppz2p также участвует в контроле эффективности нонсенс-супрессии (см. рисунок 6).

Рисунок 6. Делеция генов PPZ1 и PPZ2 приводит к аллосупрессии по отношению к фактору [PSI+]. Символом wt обозначен исходный штамм 5V-H19 [PSI+], символами ppz1, ppz2 и ppz1/2 - его производные, несущие делеции PPZ1, PPZ2 и двойную делецию этих генов, соответственно.

Далее штаммы с этими делециями трансформировали плазмидой YEplac195-HAL3. Мы обнаружили, что аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии HAL3 проявляется на фоне делеции PPZ2; в то же время этот эффект полностью блокирован на фоне двойной делеции PPZ1 и PPZ2 (см. рисунок 7).

Рисунок 7. Аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии HAL3 проявляется на фоне одиночных делеций PPZ1 и PPZ2, но не на фоне двойной делеции этих генов.

Таким образом, Hal3p является негативной регуляторной субъединицей и для Ppz1p, и для Ppz2p; влияние HAL3 на эффективность нонсенс-супрессии обусловлено ингибированием каталитической активности обеих этих фосфатаз.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»