WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

KPh

17-27 июня 2005 г.

67

67

60

55

Восточная Камчатка, р. Камчатка (устье)

KK

29 июня -

9 июля 2004 г.

200

200

101

60

Восточная Камчатка, бассейн р. Камчатка, оз. Азабачье

KKa

3-13 июля

2004 г.

150

-

82

60

Западная Камчатка, р. Озерная

KO

4-7 августа 2003 г.

200

200

100

100

Западная Камчатка, р. Большая

KB-03

23-30 июля 2003 г.

200

200

100

100

KB-04

11-20 августа 2004 г.

100

-

81

80

Западная Камчатка, р. Палана

KP

10-21 июля 2003 г.

200

200

100

100

Материковое побережье Охотского моря, р. Охота

Okh

22 июля

2004 г.

100

100

80

70

Северные Курильские о-ва, о. Шумшу, озерно-речной комплекс Беттобу

Kur

30 июля - 5 августа 2004 г.

60

60

60

50

Анализ полиморфизма микросателлитной ДНК нерки поведен для 720 производителей из разных районов азиатской части ареала вида. Исследование популяционной структуры нерки Западной Камчатки проведено с использованием трех типов молекулярных маркеров. Исследован полиморфизм шести микросателлитных локусов (One-108, One-109, One-111, One-114, OtsG253b, и OMM-1082), пяти SNP локусов (One-mhc109, One-mhc190, One-mhc251, One-Prl2 и One-CytB26), а также проведен анализ вариабельности случайно амплифицированной полиморфной ДНК методом RAPD-PCR со стандартным 10-нуклеотидным праймером OPA-02.

2.2. Методики молекулярно-гнетического анализа

Тотальную ДНК выделяли из фрагментов печени или спинного плавника по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984; Sambrook et al., 1989). Концентрацию и степень очистки выделенной ДНК определяли на планшетном спектрофотометре "SPECTRAmax PLUS384". Выделенную ДНК разводили до концентрации 20-50 нг/мкл для последующей амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификацию фрагментов ДНК, содержащих тетрануклеотидные микросателлитные последовательности, проводили с помощью двух мультипраймерных ПЦР, для каждой из которых были выбраны три пары праймеров с близкими значениями температуры плавления. Из каждой пары один олигонуклеотид (прямой) был модифицирован флуоресцентной меткой с максимумом эмиссии, отличающимся от двух других.

Электрофорез осуществляли по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Анализ продуктов амплификации микросателлитных локусов проводили с помощью прибора для капиллярного электрофореза. Первичные данные SNP- и RAPD-анализа любезно предоставлены к.б.н. Зелениной Д.А. Обработку электрофореграмм и определение размера аллелей микросателлитных и RAPD-локусов выполняли с помощью программ GenoSpectrum и Phoretix 1D.

2.3. Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных биоанализа проведена с использованием пакета прикладных программ SPSS 10.0. Классификацию выборок осуществляли с помощью дискриминантного анализа. Снижение размерности данных проводили методом главных компонент. Визуализацию матрицы попарных межвыборочных геометрических дистанций "в городских кварталах" осуществляли с помощью многомерного шкалирования. Сравнение выборок проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Анализ данных ДНК-фингерпринтинга. При анализе RAPD-профилей учитывали амплифицированные фрагменты размером от 100 до 800 пн. Частоты рецессивных аллелей RAPD-локусов, их дисперсии Var(), несмещенные оценки гетерозиготности и средние значения по всем локусам рассчитывали по формулам, предложенным Животовским (Zhivotovsky, 1999). На основании стандартных генетических расстояний Неи методом невзвешенных парно-групповых средних (UPGMA) с помощью программы TFPGA строили дендрограмму генетического сходства популяций нерки. Достоверность различий между популяциями по частотам RAPD-фрагментов оценивали с использованием вероятностного теста в программе TFPGA. Тест на принадлежность к популяции (assignment-test) проводили с помощью специально разработанного нами программного обеспечения (Хрусталева и др., 2004) по формуле для доминантных генетических маркеров (Campbell et al., 2003). Многомерный анализ данных осуществляли с помощью демо-версии программного пакета BioNumerics.

Основные генетические показатели популяций по результатам анализа полиморфизма микросателлитных локусов и SNP-анализа были получены с помощью программ TFPGA, Genepop 3.4, Microsatellite analyzer (MSA) 3.12, Population, TreeV 1.6.6 и Arlequin 2.0. Частоты аллелей в исследованных выборках, тесты на соответствие равновесию Харди-Вайнберга и проверку неравновесия по сцеплению рассчитывали с применением метода цепей Маркова в программе Genepop 3.4. Гетерозиготность в выборках и определение соответствия наблюдаемого и ожидаемого числа аллелей на локус согласно двум моделям мутационного процесса микросателлитных локусов проводили с помощью программы MSA 3.12. Расчет генетических дистанций Неи,, хордового расстояния и построение дендрограмм методом UPGMA- с помощью программ Population, TreeV 1.6.6 и TFPGA. Достоверность филогенетических построений оценивалась с помощью бутстрэп-анализа (1000 итераций). Оценки межпопуляционной дифференциации аллельных частот - Fst (st) и аналогичные оценки, основанные на корреляции с длинами аллелей - Rst (st) рассчитывали с помощью программы Genepop 3.4. Для проверки гипотезы изоляции расстоянием попарные межвыборочные генетические расстояния Fst (Rst) были изображены графически как функция географических дистанций, значимость регрессии между Fst (Rst) и физическими дистанциями проверена с помощью Мантель-теста в программе Isolda (Genepop 3.4). Многомерный статистический анализ генетических данных выполняли в программе SPSS 10.0.

Глава 3. эффективность использования различных типов маркеров для изучения популяционной структуры и определения популяционной принадлежности нерки Западной Камчатки

3.1. Биологические показатели нерки рек западного побережья Камчатки

Анализ возрастной структуры нерки рек западной Камчатки показал, что большинство особей из рек Большая, Озерная и Палана проводит в море 3 года. Продолжительность пресноводного периода у нерки из разных водоемов воспроизводства различается. Наибольшая она у нерки р. Озерная и р. Палана, нагуливающейся в среднем два года до ската в море в озерах Курильском и Паланском, наименьшая – у нерки р. Большая, в массе скатывающейся в море в возрасте 1+. Согласно данным, имеющимся в литературе (Бугаев, 1995; Бугаев и др., 2001а, 2001б, 2002а, 2002б; Бугаев, Дубынин, 2002), и нашим наблюдениям, проведенным в 2003 г., нерка рек западного побережья Камчатки различается по ряду биологических показателей, в том числе, по длине и массе тела. Самой крупной является нерка р. Большая, самой мелкой - озерновская нерка.

Сравнение выборок нерки по шести критериям (длина и масса тела, масса порки, полный возраст, речной и морской возраст) выявило статистически значимые различия (p<0.05) между выборками по размерам, массе и общей продолжительности жизни особей всех трех популяций, а также по продолжительности речного и морского периодов жизни между выборкой р. Большая с одной стороны и выборками рек Озерная и Палана с другой. Это позволяет использовать основные биологические характеристики в качестве маркеров при определении популяционной принадлежности особей. Однако, биологические показатели, такие как масса, длина, возраст производителей и количество лет проведенных неркой в море, коррелируют между собой.

Для сокращения числа переменных и выявления скрытых (не поддающихся непосредственному измерению) компонент изменчивости (факторов), объясняющих взаимообусловленность биологических характеристик мы воспользовались процедурой снижения размерности. Из набора четырех основных характеристик (длина, масса тела, речной и морской возраст), были выделены два фактора объясняющих в сумме 76% общей изменчивости биологических признаков. Затем по результатам дискриминантного анализа была построена модель, включающая оба фактора в качестве переменных, позволяющая дифференцировать выборки производителей нерки западного побережья Камчатки (рис. 1). С помощью полученной модели была выполнена классификация особей каждой из исследуемых выборок. Доля корректных определений в среднем составила 60% (табл. 2).

Рис. 1. Расположение выборок рек Большая (KB), Озерная (KO), Палана (KP) в пространстве двух канонических дискриминантных функций.

Низкая эффективность определения популяционной принадлежности особей по основным биологическим характеристикам обусловливает необходимость применения для дифференциации локальных стад нерки западной Камчатки других типов маркеров.

3.2. Молекулярные ДНК-маркеры в изучении популяционной структуры и определении популяционной принадлежности нерки западной Камчатки

В популяциях нерки Западной Камчатки все исследуемые микросателлитные и SNP локусы были полиморфны, при этом в большинстве выборок обнаружено статистически значимое соответствие наблюдаемых и ожидаемых при равновесии Харди-Вайнберга частот генотипов. Общее число ДНК-фрагментов в RAPD-спектрах составило 71, доля полиморфных RAPD-локусов в выборках варьировала от 64 до 71%.

Исследованные нами закономерности изменчивости трех типов молекулярных маркеров ДНК в популяциях нерки рек Большая, Озерная, Палана подтверждают, что наиболее высокий уровень полиморфизма характерен для кодоминантных микросателлитных локусов, гетерозиготность которых (= 0.888) почти в пять раз превышает гетерозиготность RAPD-маркеров (= 0.189) и в два раза - SNP-маркеров (= 0.409). При этом сходство оценок генетической изменчивости в популяциях нерки западной Камчатки обнаруживается по всем трем типам маркеров. Наиболее высокая гетерозиготность была отмечена в выборке р. Озерная, что, очевидно, обусловлено огромной численностью курильской нерки, составляющей более 70% численности данного вида в Азии. Высокодостоверные различия между западнокамчатскими популяциями нерки были выявлены по частотам аллелей всех исследуемых молекулярных маркеров.

В результате кластеризации методом многомерного шкалирования на основе матрицы коэффициентов кросс-корреляции Дайса индивидуальных RAPD-спектров нерки западного побережья Камчатки особи объединились в три группы, каждая из которых соответствует отдельной локальной популяции (рис. 2).

Рис. 2. Генетическая дифференциация нерки западного побережья Камчатки, полученная методом многомерного шкалирования данных RAPD-анализа; - р. Большая; - р. Озерная; - р. Палана.

UPGMA-дендрограммы генетического сходства популяций нерки, построенные по дистанциям Неи, рассчитанным по частотам аллелей RAPD-локусов, микросателлитных и SNP-локусов, характеризовались высокой степенью надежности, о чем свидетельствуют значения индексов бутстрепа, однако имели различную топологию (Рис. 3). На наш взгляд, это объясняется тем, что при использовании разных методов анализа ДНК скринингу подвергаются различные области генома, и, таким образом, результаты, полученные с их помощью, при всей своей достоверности могут не вполне соответствовать друг другу. Представляется очевидным, что RAPD и SNP-маркеры, локализованные в кодирующих областях генома, могут быть подвержены различным формам отбора (Allendorf, Seeb, 2000). Кроме того, анализируемые ДНК-маркеры характеризуются разным темпом эволюционирования. Наиболее высокая частота мутаций свойственна микросателлитам (10-2-10-4 на локус за поколение), частота же однонуклеотидных замен по некоторым оценкам составляет примерно 10-9 на нуклеотид в год. При этом следует отметить высокий уровень скорелированности результатов микросателлитного и SNP-анализа.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»