WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Известно, что до 13 цикла деления в синцитиальных эмбрионах дрозофилы активность cdk1 регулируется через концентрацию циклинов и в частности циклина В (Edgar et al., 1994). Поэтому можно предположить, что увеличение концентрации циклина В активирует cdk1, в результате чего инициируется процесс фосфорилирования нуклеопоринов, и поры разбираются. Деградация циклина В происходит локально на микротрубочках веретена деления. В этой области cdk1 инактивируется, и под действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте, происходит дефосфорилирование белков пор, что приводит к сборке ЯПК и ЦП.

Предложенная нами модель, позволяет объяснить динамику ЯПК и ЦП в процессе клеточного цикла и синцитиального развития эмбриона. Наши наблюдения показали, что, в телофазе ПП расположены в экваториальной зоне веретена деления бластодермальных ядер. Ранее было продемонстрировано, что инактивация митотической киназы в телофазе регистрируется в районе веретена деления бластодермальных ядер (Su et al., 1998), что, как мы предполагаем, и вызывает сборку ПП.

Мы установили также, что на 7-8 циклах деления, в интерфазе, стопки ПП имеют небольшие размеры и гомогенно распределены по цитоплазме эмбриона. Так как до 8 цикла деления ядер уровень циклина В в цитоплазме эмбриона постоянно высок, предполагают, что и активность cdk1 повышена на протяжении всего клеточного цикла (Edgar et al., 1994). Эти данные согласуются с нашими наблюдениями и позволяют предположить, что малые размеры стопок ПП на этих циклах деления обусловлены повышенной активностью cdk1.

Согласно нашим наблюдениям, на 13-14 циклах деления синцитиальной бластодермы, ЯПК в желточных ядрах и ЦП около них разбираются в митозе не полностью (Рис. 2 в), и в центре эмбриона наблюдаются крупные ПП. Подобная динамика ЯПК и ЦП может быть обусловлена сниженной активностью cdk1 в центральной области эмбриона. Наше предположение подтверждается литературными данными, которые показали, что в желточных ядрах не происходит фосфорилирования гистона Н3 (Su et al., 1998). Поскольку он является субстратом для cdk1, это может свидетельствовать о сниженной активности митотической киназы в центре эмбриона. Совокупность наших наблюдений и литературных данных позволяют предположить, что снижение активности cdk1 приводит к укрупнению ПП и неполной разборке ЯПК и ЦП в митозе. Возможно, снижение активности cdk1 обусловлено недостатком циклинов А и В. Работы проведенные на синцитиальных эмбрионах дрозофилы показали, что мутация по циклину А приводит к эндорепликации хроматина бластодермальных ядер (Sauer et al., 1995), что является характерным для желточных ядер в норме. Можно предположить, что низкая концентрация циклинов А и В, необходимых для активации cdk1, обусловлена низким уровнем их синтеза в этой области эмбриона, так как в конце синцитиального развития центр клетки в основном заполнен желтком и фосфолипидами, и содержит лишь небольшое количество шероховатого ЭПР. В то же время, нельзя исключить возможность существования другой причины снижения концентрации циклинов вблизи желточных ядер.

Влияние Ran на сборку ядерных и цитоплазматических пор

Недавние исследования, проведенные in vitro и in vivo показали, что малая ГТФ-аза Ran оказывает влияние на процесс сборки ЯдО, ЯПК и ПП (Ryan et al., 2003; Walther et al., 2003). Неактивная форма Ran - Ran-ГДФ локализуется в цитоплазме клетки, где специфический фактор RanGAP, инициирует гидролиз Ran-ГТФ до Ran-ГДФ. Неактивная форма Ran транспортируется в ядро, где затем переходит в активную форму - Ran-ГТФ - при участии белка RCC1 (Regulate Chromosom Condensation), который локализуется на хроматине и необходим для его деконденсации в телофазе. Ran-ГТФ осуществляет отщепление импортируемого комплекса от ЯПК и сборку экспортируемого комплекса, вместе с которым он затем транспортируется в цитоплазму. Белки RCC1 и RanGAP поддерживают компартментализацию активной и неактивной формы Ran в клетки: Ran-ГТФ - в ядре, а Ran-ГДФ - в цитоплазме (Clarke, Zhang, 2004). Исследования, проведенные in vitro на грубом экстракте из ооцитов Xenopus laevis, показали, что повышение концентрации Ran-ГТФ инициирует сборку ЦП. Это позволило предположить, что для сборки ЯПК необходим Ran-ГТФ, который, возможно, освобождает нуклеопорины от транспортных факторов, что делает их доступными для сборки пор (Harel et al., 2003; Walther et al., 2003). Существуют также данные о том, что цикл Ran необходим для формирования ЯПК у дрожжей (Ryan et al., 2003). Для выяснения влияния Ran на процесс сборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы, нами были предприняты попытки изменить компартментализацию активной и неактивной формы Ran в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.

Наши исследования показали, что в результате последовательных микроинъекций мутантной формы Ran (RanT24N), который блокирует функцию RCC1 и не способен связываться с ГТФ, а затем циклогексимида (см. выше) блокируется сборка ЯПК (Рис. 9 б). При этом наблюдался компактный хроматин, окруженный прерывистой двухслойной оболочкой, в которой не содержались ЯПК (Рис. 9 б). В то же время, данная инъекция не влияла на сборку ПП (Рис. 9 а), которые располагались в цитоплазме эмбриона в виде стопок и содержали ЦП нормального строения (Губанова и др. 2006).

Рис. 9. Влияние инъекций RanT24N и циклогексимида на сборку ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах D.melanogaster линии Canton S. а – вид стопки пористых пластинок и цитоплазматических пор; б- фрагменты ядерной оболочки (черная стрелка указывает на разрыв оболочки). Я – ядро.

Согласно последним данным, для инициации сборки новых ядерных пор в интактной ЯдО необходим комплекс Nup107-160, который выявляется в участках формирования новой ЯПК в ЯдО, как с ядерной, так и с цитоплазматической стороны (D`Angelo et al., 2006). Параллельно было показано, что для встраивания ЯПК требуется также присутствие Ran-ГТФ в ядерном и цитоплазматическом отделе поры (D`Angelo et al., 2006). Известно, что белок Nup107 связывается с транспортным фактором импортином и расположен во внутриядерном отделе ЯПК (Walther et al., 2003). Можно предположить, что Ran-ГТФ освобождает комплекс Nup107-160 от связывания с импортином, что делает этот комплекс доступным для инициации формирования ЯПК. В этом случае отсутствие Ran-ГТФ, вызванное инъекцией мутантной формы Ran, может нарушать процесс формирования ЯПК на стадии инициации этого процесса.

Тот факт, что инъекции RanT24N и циклогексимида не влияет на сборку ЦП, не является удивительным. В нормальных клетках Ran-ГДФ находится в цитоплазме клетки, а Ran-ГТФ в ядре, что не предполагает его участие в процессе сборки ЦП. Поскольку данных о присутствии белка Nup107 в ЦП нет, это позволяет предположить, что их сборка происходит по отличному от сборки ЯПК механизму.

Рис. 10. Влияние инъекций RCC1 и циклогексимида на сборку ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах D.melanogaster линии Canton S. а - фрагмент участка цитоплазмы с радиально расположенными пористыми пластинками (белые стрелки), б - пористая пластинка, ассоциированная с микротрубочкой (черные стрелки указывают на микротрубочку).

Согласно нашим данным, микроинъекция RCC1 с последующим введением циклогексимида вызывала формирование необычно длинных, радиально расположенных микротрубочек (Рис. 10 а), с которыми были ассоциированы ПП (Рис. 10 б). При этом основная часть ПП наблюдалась в цитоплазме эмбриона, ЯдО отсутствовала, а декомпактизованный хроматин диффузно располагался в цитоплазме синцития. В работах, проведенных ранее, показано, что Ran-ГТФ вызывает формирование длинных микротрубочек, а присутствие Ran-ГТФ на хроматине определяет направление их роста (Gruss et al., 2001; Wiese et al., 2001; Nachury et al., 2001). Эти данные подтверждают, что проведенные нами инъекции увеличивают содержание Ran-ГТФ в цитоплазме эмбриона, в результате чего, возможно, нарушается формирование веретена, ЯдО и ЯПК. Присутствие же в цитоплазме ПП с нормальными ЦП, свидетельствует о том, что ни Ran-ГТФ, ни Ran-ГДФ, вероятно, не оказывают влияния на сборку ЦП (Губанова и др. 2006).

Совокупность изложенных данных позволяет сделать вывод, что, несмотря на существование общих факторов, контролирующих процессы сборки-разборки ЯПК и ЦП в митозе, на сборку ЯПК влияют дополнительные факторы, например, компартментализация активной и неактивной формы Ran, и сборка ЯПК представляет более сложно регулируемый процесс по сравнению со сборкой ЦП.

Выводы

  1. Установлено, что цитоплазматические поры в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster содержат лишь небольшую часть нуклеопоринов. При этом основная часть белков ядерных пор присутствует в растворенном виде в цитозоле.
  2. Обнаружено, что активность митотической киназы cdk1 регулирует процесс сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster.
  3. Установлено, что для сборки ядерных и цитоплазматических пор необходима активность фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте.
  4. Предложена модель регуляции митотической сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster, согласно которой этот процесс регулируется динамическим равновесием между активностью cdk1 и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте.
  5. Получены данные, свидетельствующие о взаимосвязи между укрупнением пористых пластинок и снижением активности cdk1 в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster.
  6. Продемонстрировано, что малая ГТФ-аза Ran участвует в формировании ядерной оболочки и ядерных пор и не влияет на формирование цитоплазматических пор и пористых пластинок.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика и функция окончатых мембран в ранних эмбрионах Drosophila melanogaster // Тезисы докладов Х1Х Российской конференции по электронной микроскопии. Черноголовка, РАН. 2002. С. 210.
  2. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика окончатых мембран в раннем эмбриогенезе Drosophila melanogaster. Ультраструктурные исследования и морфометрический анализ. // Тезисы докладов Ш Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии». Алма-Аты, Казахстан. 2003. С. 151.
  3. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Электронно-микроскопический анализ динамики окончатых мембран в раннем эмбриогенезе у Drosophila melanogaster. Ультраструктура пороподобных комплексов в процессе митоза. // Тезисы докладов Международного Симпозиума по проблемам мейоза. Санкт-Петербург, Цитология. 2003. Т.45(9). С. 252.
  4. Onischenko E.A., Gubanova N.V., Kiseleva E.V., Hallberg E. Downregulated assembly of annulate lamellae in syncytial Drosophila embryos // International Symposium: Communication and gene regulation at the nuclear envelope. The University of Durham, Great Britain. 2003. P. 26.
  5. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Сравнительный анализ структурно-функциональной организации окончатых мембран и ядерной оболочки в раннем эмбриогенезе дрозофилы // Тезисы докладов. III съезд ВОГиС. «Генетика в XXI: современное состояние и перспективы развития», Москва, Россия. 2004. Т. II С. 281.
  6. Onischenko EA, Gubanova NV, Kieselbach T, Kiseleva EV, Hallberg E Annulate lamellae play only a minor role in the storage of excess nucleoporins in drosophila embryos. // Traffic. 2004. V. 5. Р. 152-164.
  7. Onischenko E.A., Gubanova N.V., Kiseleva E.V., Hallberg E. Cdk1 and оkadaic acid-sensitive phosphatases control assembly of nuclear pore complexes in Drosophila embryos. // Mol. Biol. Cell. 2005. V. 16. Р. 5152-5162.
  8. Морозова К.Н., Губанова Н.В., Киселева Е.В. Структурная организация и возможная функциональная роль пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры. // Цитология. 2005. Т. 47(8). С. 667-678.
  9. Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Малая ГТФ-азы Ran влияет на сборку ядерных пор, но не участвует в сборке цитоплазматических поровых комплексов. // Тезисы докладов. X Международная молодежная Школа-конференция, Владивосток, Россия. 2006. С. 132.
  10. Губанова Н.В., Морозова К.Н., Киселева Е.В. Структурная организация и функция ядерных пор. // Цитология. 2006. Т. 48(11). С. 887-899.
  11. Губанова Н.В., Киселева Е.В. Структурная организация и функция ядерной оболочки // Цитология. 2007. Т. 49(3) (в печати).
Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»