WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Из ранее проведенных работ известно, что в интерфазе ЯПК находятся в собранном состоянии и состоят из трех отделов: центрального, содержащего транспортер, и двух ассиметричных периферических – цитоплазматического, с цитоплазматическими фибриллами, и внутриядерного, содержащего баскет-структуру (Kiseleva et al., 1996, 1998, 2001). Наши исследования ультраструктуры ядерных и цитоплазматических пор на стадии интерфазы продемонстрировали, что ЦП и ЯПК имеют сходный вид на гексагональных срезах (Рис. 1 в, г), но различаются на поперечных срезах. ЦП не содержат баскет-структуру (Рис. 1 а), при этом в них наблюдаются два сходных периферических отдела, соответствующих по строению цитоплазматическому отделу ЯПК (Рис. 1 б).

В работах других авторов было показано, что ЦП содержат нуклеопорины, характерные для цитоплазматического и центрального отдела ЯПК, в то время как белков, входящих в состав баскет-структуры, в ЦП обнаружено не было (Cordes et al., 1995), что согласуется с нашими наблюдениями. Также известно, что наружная мембрана ЯдО проявляет сходство с мембранами ЭПР, тогда как внутренняя мембрана контактирует с ламиной и содержит специфические белки. Мембраны же ПП обе идентичны мембранам ЭПР, что, возможно, и обуславливает сборку сходных периферических отделов в ЦП, соответствующих цитоплазматическому отделу ЯПК.

Рис. 1. Ультраструктура ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах D. melanogaster линии Canton S на стадии интерфазы (Onischenko, Gubanova et al., 2004); а – общий вид стопки пористых пластинок на поперечном срезе; вставка – цитоплазматические поры на большем увеличении (пунктиром обозначены цитоплазматические фибриллы); б – фрагмент ядерной оболочки на поперечном срезе; вставка – ядерные поры на большем увеличении (пунктиром обозначена баскет-структура); в – пористая пластинка на гексагональном срезе; вставка – гексагональный срез цитоплазматических пор на большем увеличении; г – гексагональный срез ядерной оболочки; вставка – гексагональный срез ядерных пор на большем увеличении.

Наши исследования продемонстрировали синхронность сборки-разборки ЯПК (Рис. 2 а) и ЦП (Рис. 2 б) в митозе, что полностью совпадает с данными ранее опубликованных работ (Zatsepina et al., 1977; Stafstrom, Staehelin, 1984). Дополнительно было установлено, что, если ЯПК в течение митоза разбираются не полностью, как это имеет место в центральной области эмбриона, где расположены желточные ядра, то и расположенные около них ЦП, демонстрируют сходную динамику (Рис. 2 в).

Рис. 2. Ультраструктура ЯдО и ПП в эмбрионе на стадии метафазы бластодермальных ядер; а – отсутствие ЯПК в оболочке бластодермального ядра; б – отсутствие ЦП в ПП около бластодермальных ядер; в – компоненты ЯПК (черные стрелки) в оболочке желточного ядра и компоненты ЦП (белые стрелки) в ПП около желточного ядра.

По нашим наблюдениям, в телофазе, ЦП собираются более активно и формируют стопки ПП, при чем с той стороны ядра, где еще не сформирована ЯдО, т.е. в экваториальной области веретена деления (Рис. 3 а, б).

Рис. 3. Бластодермальные ядра и пористые пластинки на стадии телофазы в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.

а, б - вид ядер в телофазе и расположенных вблизи них пористых пластинок. Видно, что ядерные поры (черные стрелки) распределены в ядерной оболочке неравномерно, стопки пористых пластинок (белые стрелки) расположены преимущественно с той стороны ядра, где ядерная оболочка не сформирована. ХР – хроматин, Я -ядро.

При исследовании синцитиальных эмбрионов на стадии интерфазы бластодермальных ядер мы обнаружили гетерогенность в распределении и морфологии ПП. Наши исследования показали, что на 7-8 циклах деления стопки ПП имеют небольшие размеры и гомогенно распределены по цитоплазме эмбриона. На более поздних циклах деления - 11, 13 и 14, распределение ПП гетерогенно, они представлены крупными стопками в центральной области эмбриона, где располагаются полиплоидные желточные ядра, небольшими - в средней области цитоплазмы, и единичными ПП вблизи быстро делящихся бластодермальных ядер.

Эти наблюдения позволили предположить существование общего фактора, который регулирует процессы сборки-разборки ЯПК и ЦП, но имеет разную активность в различных участках цитоплазмы эмбриона. Ранее было показано, что активность митотической киназы cdk1 на 11-14 циклах деления снижена в центральной области эмбриона и повышена на периферии (Su et al., 1998). Мы предположили, что именно этот фактор может воздействовать на сборку-разборку ЯПК и ЦП, и влиять на морфологию ПП.

Исследование функции пористых пластинок в синцитиальных эмбрионах дрозофилы

Известно, что в ооцитах Xenopus laevis на VI стадии оогенеза основное количество нуклеопорина Nup62 находится в составе ЦП ПП (Cordes et al., 1995). На основании этого, а также других исследований (Kessel et al., 1992; Stafstrom, Staehelin, 1984) предполагалось, что фундаментальной функцией ПП является сохранение и запас избыточных нуклеопоринов.

Рис. 4 Диаграмма, демонстрирующая количество ядерных и цитоплазматических пор на эмбрион на 7-8, 11, 13 и 14 циклах деления эмбриона D. melanogaster линия Canton S (Onischenko, Gubanova et al., 2004).

Для того, чтобы проверить, могут ли ПП в ранних эмбрионах дрозофилы выполнять такую функцию, мы провели сравнительное морфометрическое исследование количества ядерных и цитоплазматических пор на разных циклах синцитиального развития дрозофилы (Рис. 4). Наши данные показали, что количество ЦП от 7-8 до 14 цикла деления остается примерно на одном уровне и составляет 6-7 миллионов ЦП на эмбрион, тогда как количество ЯПК увеличивается в геометрической прогрессии примерно от 0,4 до 23 млн. ЯПК/на эмбрион (Onischenko, Gubanova et al., 2004). Эти данные свидетельствовали, о том, что количество нуклеопоринов, содержащихся в ЦП, является не достаточным для сборки новых ЯПК в делящихся ядрах на стадии синцитиальной бластодермы.

Проведенный далее молекулярно-биологический анализ показал, что семь исследованных нами нуклеопоринов представлены в цитозоле, ПП и ЯдО, при чем основное их количество находится в растворенной форме в цитозоле синцития, тогда как ЦП и ЯПК содержат лишь незначительную часть этих белков. Таким образом, результаты наших исследований опровергают фундаментальность функции пористых пластинок как запасающего компартмента (Onischenko, Gubanova et al., 2004).

Отличие в распределении нуклеопоринов, обнаруженное нами в синцитиальных эмбрионах дрозофилы, по сравнению с тем, что было описано для ооцитов Xenopus laevis на VI стадии оогенеза (Cordes et al., 1995б), можно объяснить различными условиями, при которых белки собираются в ЯПК. В ооцитах амфибий, на VI стадии развития, ЯдО прекращает свой рост, и, возможно, поэтому нет необходимости иметь большой запас растворенных нуклеопоринов в цитоплазме для сборки ЯПК. В синцитиальных эмбрионах дрозофилы, где ядра делятся каждые 9 минут (Foe, Alberts, 1983) требуется, вероятно, наличие большого количества резервных белков, готовых к непосредственному использованию для быстрой сборки новых ЯПК. Мы предположили, что при таком быстром обороте белков ЯПК, нуклеопорины поддерживаются в цитоплазме в растворенном виде, что, возможно, обеспечивает их эффективное использование для сборки ЯПК в ядрах синцитиальных эмбрионов дрозофилы.

Cdk1 и фосфатазы, чувствительные к окадаевой кислоте, являются ключевыми регуляторами сборки/разборки ядерных и цитоплазматических пор в митозе

Известно, что в эукариотической клетке переход к митозу происходит в результате активации митотических киназ. На стадии профазы митотическая киназа cdk1 фосфорилирует множество белков в цитоплазме и ядре клетки, в результате чего происходят структурные изменения цитоскелета, ЯдО и хроматина. Известно, что для активации cdk1 необходимы циклины – регуляторные белки, которые синтезируются в интерфазе и, связываясь с cdk1, переводят ее в активное состояние. Особенностью циклинов является наличие специализированного сайта – бокса деструкции, обеспечивающего их быструю деградацию, что позволяет своевременно инактивировать cdk1 в конце митоза (Arellano, Moreno, 1997).

Для изучения влияния активности митотической киназы cdk1 на процесс сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор, мы использовали ранние эмбрионы дрозофилы на 9-13 циклах деления синцитиальной бластодермы. Для инактивации cdk1 использовалось несколько подходов: 1) снижение концентрации циклинов и 2) инактивация непосредственно самой митотической киназы. Нарушение синтеза циклинов вызывалось инъекцией циклогексимида, блокирующего синтез белков на стадии трансляции. В результате проведенного воздействия в эмбрионах наблюдалась остановка клеточного цикла на стадии интерфазы. Эмбрионы характеризовались крупными ядрами неправильной формы с интактными ЯПК, ПП имели нормальные ЦП, и их количество составляло около 8 млн. (Рис. 5).

Рис. 5. Диаграмма, демонстрирующая изменение количества цитоплазматических пор на эмбрион (D. melanogaster линии Canton S) после инъекции циклогексимида, циклогексимида и GST-циклина В или буфера (Onischenko, Gubanova et al., 2005).

При одновременной инъекции в эмбрионы циклогексимида и недеградируемой формы циклина В (GST-циклина В), в цитоплазме синцитиальных эмбрионов наблюдались ЯдО без ЯПК и ПП с разобранными ЦП, количество которых во всем эмбрионе было значительно снижено (Рис. 5).

При исследовании png-мутантов, характеризующихся сниженным уровнем митотических циклинов А и В, были зарегистрированы ядра гигантского размера с нормальными ЯПК и крупные стопки ПП в цитоплазме эмбрионов. Морфометрический анализ количества ЦП в мутантных эмбрионах показал, что в одном эмбрионе насчитывается около 12 млн. ЦП. При введении в эти эмбрионы GST-циклин В наблюдалась разборка ЦП и уменьшение их количества до 0,73 млн. ЦП/эмбрион (Рис. 6 ).

Рис. 6. Диаграмма, демонстрирующая изменение количества цитоплазматических пор на эмбрион, в png-мутанте (D.melanogaster линия png172) после инъекции буфера или недеградируемой формы циклина В (GST-циклин В). (Onischenko, Gubanova et al., 2005).

Сходная картина была обнаружена нами при ультраструктурном исследовании мутантных эмбрионов, несущих термочувствительную мутацию в гене cdk1, которая инактивировала киназу при повышении температуры. Эмбрионы на 9-13 циклах деления выдерживались при температуре 300С, а затем подвергались ультраструктурному анализу, показавшему, что ядра имеют более крупный размер по сравнению с нормой, а ЯдО образует инвагинации и содержит нормальные ЯПК. При этом в цитоплазме эмбрионов обнаруживались стопки ПП с ЦП, характерными для стадии интерфазы, в количестве около 5 млн. (Рис. 7). Таким образом, наши исследования наглядно продемонстрировали, что активность митотической киназы cdk1 регулирует процесс сборки-разборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.

Рис. 7. Диаграмма, демонстрирующая изменение количества цитоплазматических пор на эмбрион в термочувствительном мутанте D.melanogaster линия cdk1ts (A171T) после инкубации при 300С; при 220С и D.melanogaster Сanton S при 300С (Onischenko, Gubanova et al., 2005).

Согласно данным, полученным Е.А.Онищенко in vitro, комплекс cdk1/циклин В, вызывает диссоциацию пяти нуклеопоринов из ЯПК, при этом один из пяти нуклеопоринов – белок р150, находится в фосфорилированном состоянии (Onischenko, Gubanova et al., 2005). Эти данные позволяет предположить, что митотическая киназа напрямую или опосредовано вызывает фосфорилирование некоторых нуклеопоринов и нарушает их взаимодействие с другими белками, входящими в состав ЯПК, что инициирует разборку порового комплекса. Недавно полученные данные показали, что до разборки ЯдО в ооцитах Xenopus laevis, комплекс - cdk1-циклин В в неактивном состоянии локализуется на ЦП пористых пластинок (Beckhelling et al., 2003). Это позволяет предполагать, что комплекс cdk1-циклин В в синцитиальных эмбрионах дрозофилы способен непосредственно связываться с поровыми комплексами в цитоплазме и ЯдО. Вместе с тем, показано, что в гифах мицелия гриба Aspergillus nidulans, где митоз протекает по закрытому типу – без разборки ядерной оболочки, фосфорилирование нуклеопоринов производится серин-треониновой киназой NIMA, которая активируется cdk1. Хотя гиперэкспрессия NIMA в клетках млекопитающих может индуцировать разборку ЯПК (Lu, Hunter, 1995), найти гомолог этого фермента у высших эукариот так и не удалось. Возможно, NIMA играет специфическую роль в реорганизации поровых комплексов при закрытом митозе. Эти данные свидетельствуют о том, что, кроме cdk1, в разборке поровых комплексов могут принимать участие и другие киназы.

Если для разборки ЯПК и ЦП необходимо фосфорилирование нуклеопоринов, то для их сборки требуется обратный процесс – дефосфорилование. Для исследования роли фосфатаз в процессе пост-митотической сборки пор, в синцитиальные эмбрионы дрозофилы была инъецирована окадаевая кислота в концентрации, которая специфически ингибирует белковые фосфатазы РР1 и РР2А. В результате этого, в эмбрионах происходила разборка пор в профазе, но их сборка не наблюдалась. Полученные данные позволяют сделать вывод, что фосфатазы (одна или обе) необходимы для пост-митотической сборки ЯПК и ЦП. Предполагаемое участие РР1 и РР2А в сборке ЯПК согласуется с множеством данных о роли фосфатаз в активации пост-митотических изменений в клетке. Так, например, на культуре клеток показано, что избыток РР1 стимулирует выход из митоза, тогда как микроинъекция антител к фосфатазе РР1, блокирующих ее действие, приводит к задержке клеток в митозе (Fernandez et al., 1992). Имеются также свидетельства участия РР1 в пост-митотической сборке ламины (Thompson et al., 1997; Steen et al., 2000), тогда как РР2А играет ключевую роль в пост-митотической сборке аппарата Гольджи (Lowe et al., 2000).

Таким образом, наши исследования, в совокупности с данными других авторов, показали, что фосфатазы, чувствительные к окадаевой кислоте, необходимы для пост-митотической сборки ядерных и цитоплазматических поровых комплексов. На основании этого мы предложили модель, согласно которой сборка/разборка ядерных и цитоплазматических пор в ранних эмбрионах дрозофилы регулируется динамическим равновесием между действием митотической киназы cdk1, с одной стороны, и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте, с другой стороны (Рис. 8).

Рис. 8. Схематическая модель регуляции сборки /разборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы (Onischenko, Gubanova et al., 2005)

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»