WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

губанова наталья владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ФОРМИРОВАНИЯ И МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ СБОРКИ-РАЗБОРКИ ЯДЕРНЫХ И ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ПОР В СИНЦИТИАЛЬНЫХ ЭМБРИОНАХ DROSOPHILA MELANOGASTER

Гистология, цитология, клеточная биология – 03.00.25

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Новосибирск, 2006

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Киселева Елена Владимировна,

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Высоцкая Людмила Васильевна,

Новосибирский государственный университет,

г. Новосибирск

доктор биологических наук

Захаров Илья Кузьмич,

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт систематики и экологии животных СО РАН, Новосибирск

Защита диссертации состоится «24» января 2007 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д – 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан « » декабря 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев

Актуальность проблемы. Между ядром и цитоплазмой эукариотической клетки постоянно происходит обмен информационными молекулами (мРНК) и белками - регуляторами репликации, транскрипции и трансляции. Дефекты в механизмах этого процесса могут вести к нарушению экспрессии генов, что может иметь серьезные последствия, начиная с отклонения в развитии организма и заканчивая злокачественным перерождением тканей. С этой точки зрения исследование функциональных взаимоотношений между ядром и цитоплазмой имеет не только фундаментальное научное значение, но и является актуальным вопросом, имеющим приложение в современной медицине. Основную роль в регуляции обмена между ядром и цитоплазмой играют ядерные поровые комплексы (ЯПК) – специфические каналы в ядерной оболочке (ЯдО), через которые осуществляется активный и пассивный обмен макромолекул. ЯПК являются сложными надмолекулярными структурами, в формировании которых принимает участие около 30 различных белков, называемых нуклеопоринами. Изучение механизмов формирования ЯПК является одной из актуальных задач в исследовании регуляторных механизмов ядерно-цитоплазматического транспорта.

Одним из подходов в изучении формирования ЯПК является анализ особенностей их реорганизации в ходе митоза. Известно, что в начале митоза ЯПК разбираются на отдельные белковые компоненты, ламина деполимеризуется, а ядерные мембраны фрагментируются. После окончания митоза образуется сплошная двухслойная оболочка, в которой de novo формируются ЯПК. Известно, что в эукариотической клетке переход к митозу и его завершение происходят в результате активации и инактивации митотических киназ, что вызывает структурные изменения в цитоплазме и ядре клетки (Arellano, Moreno, 1997). Однако, то, как эти митотические факторы регулируют процессы сборки-разборки ЯПК, остается до сих пор мало изученными.

Показано, что в цитоплазме ооцитов и митотически активных клеток, таких, как опухолевые клетки и клетки ранних эмбрионов встречаются необычные мембраны, содержащие структуры, сходные с ЯПК и называемые цитоплазматическими порами (ЦП) или пороподобными комплексами. ЯПК и ЦП сходны по морфологии, белковому составу, а также проявляют синхронность в процессе обратимой реорганизации в митозе. Мембраны, содержащий ЦП, обозначают как пористые пластинки (ПП) или окончатые мембраны. Они могут быть представлены одиночными пластинками или, чаще, стопками пластинок, расположенных в цитоплазме клетки. Существует предположение, что ПП являются запасающим компартментом нуклеопоринов для формирования ЯПК в ЯдО ооцитов амфибий. Функция ПП в соматических митотически активных клетках на сегодняшний день остается недостаточно исследованной.

Известно, что малая ГТФ-аза Ran принимает активное участие в ядерно-цитоплазматическом транспорте, а также регулирует процессы формирования митотического веретена и ЯдО (Clarke, Zhang, 2004). Недавние исследования продемонстрировали, что Ran контролирует также сборку ЯПК у дрожжей (Ryan et al., 2003) и ЦП в системе in vitro (Walter et al., 2003), однако механизмы этого процесса изучены не достаточно.

Наиболее удобным объектом для изучения регуляции митотической реорганизации ЯПК и ЦП являются эмбрионы дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы. В них ядра претерпевают 13 быстрых синхронных делений, что позволяет получать образцы, содержащие ядра на разных стадиях клеточного цикла. В цитоплазме эмбриона присутствуют также ПП, которые синхронно собираются и разбираются в ходе митоза. В дополнение к этому, начиная с 9 цикла деления, ядра разделяются на две популяции: быстро делящиеся на периферии эмбриона бластодермальные ядра, и находящиеся в центре эмбриона и не подверженные делению, полиплоидные желточные ядра. Это предполагает существование различий в митотической реорганизации ядер и расположенной рядом с ними цитоплазмы в центральной и периферической областях эмбриона. Синцитиальные эмбрионы дрозофилы удобны также для манипуляций и наблюдения с помощью конфокальной и электронной микроскопии. На основании этого были сформулированы следующие цель и задачи настоящего исследования.

Цель диссертационной работы – изучение регуляции митотической реорганизации ядерных и цитоплазматических пор и анализ их функционального взаимодействия в эмбрионах дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы.

В работе решались следующие конкретные задачи:

1. Провести электронно-микроскопический анализ динамики ядерной оболочки и пористых пластинок на разных стадиях клеточного цикла.

2. Выяснить являются ли пористые пластинки запасающим компартментом нуклеопоринов в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.

3. Определить, как активность митотических киназ и фосфатаз влияет на сборку-разборку ядерных и цитоплазматических пор.

4. Определить влияние малой ГТФ-азы Ran на процесс сборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.

Новизна и научная ценность работы:

С использованием методов электронной микроскопии, морфометрического анализа и микроинъекций впервые показано, что основная часть нуклеопоринов находится в растворенном состоянии в цитоплазме синцития и ПП не являются основным запасающим компартментом для белков ядерных пор. Установлено, что процесс сборки-разборки ЯПК и ЦП регулируется динамическим равновесием между активностью митотической киназы cdk1 и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте. На основании проведенных исследований предложена модель регуляции сборки/разборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. Продемонстрировано, что малая ГТФ-аза Ran участвует в формировании ядерной оболочки и ядерных пор и не влияет на формирование цитоплазматических пор. Показано, что синцитиальные эмбрионы дрозофилы являются удобной экспериментальной моделью для изучения процессов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор in vivo.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в 2002 и 2005 гг., ХIX Российской конференции по электронной микроскопии (Москва, 2002), III Международной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии» (Казахстан, Алма-Аты, 2003.), Международном симпозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, 2003), Международном симпозиуме «Ядерная оболочка в передаче информации и генной регуляции» (Дарем, Великобритания, 2004), III съезде ВОГИС (Москва, 2004) и Дальневосточной школе-конференции (Владивосток, 2006).

Вклад автора

Автором были зафиксированы образцы эмбрионов дрозофилы и приготовлены препараты для световой и электронной микроскопии, проведен качественный анализ электронно-микроскопических образцов, а также выполнен морфометрический анализ количества ЯПК и ЦП.

Гель электрофорез, Вестерн-блот анализ, субфракционирование, количественная оценка содержания нуклеопоринов в различных фракциях, конфокальная микроскопия и микроинъекции были проведены Е.А.Онищенко (Содерторнский университетский колледж, Стокгольм, Швеция).

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 214 ссылок. Работа изложена на 144 страницах печатного текста, содержит две таблицы и иллюстрирована 39 рисунками.

Материалы и методы

Объекты исследования

В работе использовались следующие линии Drosophila melanogaster: cdk1ts (A171T), png172 и Canton S - как дикий тип. Мухи содержались на стандартном корме при 220С. Перед отбором эмбрионов проводилась синхронизация откладки яиц. Для получения эмбрионов на 7-8 циклах деления отбор производился через 1 ч. после установки корма, для 11 и 14 циклов - через 2 и 2,5 ч. соответственно, а для более поздних стадий через 4 часа.

Электронная микроскопия

Эмбрионы фиксировались в растворах глутарового альдегида и тетраоксида осмия согласно методу, описанному ранее (Onischenko, Gubanova et al., 2004, 2005). Затем эмбрионы дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и в ацетоне, после чего заключали в эпоксидную смолу Agar100 и полимеризовали согласно стандартному протоколу. Срезы толщиной 50-80 нм, полученные на ультрамикротоме Ultracut Reichert (Австрия), переносились на медные сеточки и контрастировались растворами уранилацетата и цитрата свинца. Препараты исследовались на электронном микроскопе JEOL 100SX (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Получение, окрашивание и исследование полутонких срезов

Перед приготовлением полутонких срезов стачивалось 60 мкм толщины эмбриона, что позволяло достичь его экваториальной области. Полутонкие срезы толщиной 0,5 мкм окрашивались 1 % раствором толлуидинового синего с добавлением 1 % раствора тетрагидробората натрия и анализировались в световом микроскопе.

Определение цикла деления синцитиального эмбриона

На полутонких срезах, проходящих через экваториальную область эмбриона подсчитывалось количество ядер, что однозначно определяло цикл деления эмбриона (Zalokar, Erk, 1976). Так, для 14 цикла, на экваториальный срез приходилось от 160 до 200 ядер, для 13 - от 80 до 100 ядер, для 11 - 20-25 ядер и для 7-8 - от 2 до 4 ядер на срез.

Морфометрический анализ

Подсчет ЯПК и ЦП проводился на экране электронного микроскопа. Количество ЯПК и ЦП в эмбрионе вычислялось согласно ранее описанному методу (Onischenko, Gubanova et al., 2004, 2005), после чего определялось среднее значение и стандартная ошибка.

Вестерн-блот и определение количества белка

Белки разделялись при помощи SDS полиакриламидного гель электрофореза и переносились на нитроцеллюлозную мембрану. Блокирования неспецифического связывания производилось по стандартному протоколу с небольшими модификациями (Onischenko et al., 2004). Вестерн-блот проявлялся в ECL-реагенте и анализировался с использованием системы анализа люминесцентных изображений Las1000plus.

Для определения количества белка, эмбрионы разделялись по стадиям согласно морфологическим критериям, затем готовился гомогенат 10 эмбрионов, который лизировался в 10 мкл стандартного буфера. После электрофореза и переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, проводилась инкубация с первичными и вторичными антителами к семи нуклеопоринам. Количество белка в каждом бэнде измерялось при помощи программы ImageGauge 3.1, и выражалось в относительных единицах.

Субклеточное фракционирование

Субклеточное фракционирование было выполнено согласно методу, описанному ранее (Meller et al., 1994) с небольшими модификациями (Onischenko,Gubanova et al., 2004).

Исследование фосфорилирования нуклеопорина р150

Для адсорбции нуклеопорина р150 использовалась аффинная колонка (Pierce; Рокфорд), с соответствующими антителами. Комплекс антител с белками элюировался и обрабатывался двукратным SAP-буфером, содержащем щелочную фосфатазу SAP в течение 1 часа. Реакция останавливалась добавлением эквивалентного объема исходного буфера.

Микроинъекции и конфокальная микроскопия на живых эмбрионах дрозофилы

Эмбрионы без хориона прикреплялись к предметному стеклу, подсушивались в сухой камере 5-7 мин., а затем покрывались галокарбоновым маслом. Инъекции проводились с помощью вытянутого капилляра на микроинъекторе с воздушным управлением Microinjector 5242 (Eppendorf, США). Концентрация циклогексимида в инъецируемой смеси составляла 1 мкг/мл, GST-циклина В - 7,5 мкг/мл, окадаевой кислоты 150 мкМ. При исследовании действия малой ГТФ-азы Ran производились последовательные инъекции: RanT24N (Sigma-Aldrich) (8 мкг/мл) или RCC1 (Sigma-Aldrich) (8 мкг/мл), а затем циклогексимида (1 мкг/мл). Для наблюдения ЯПК и ЦП в живых эмбрионах производилась инъекция в них WGA-Alexa594 (0,1 млг/мл). Изображение объектов было получено с использованием конфокального микроскопа Leica TCS-SP, оборудованного программой Leica Cofocal Software 2.61.

Результаты и обсуждение

Изучение ультраструктурной динамики ядерных и цитоплазматических пор в процессе синцитиального развития эмбриона дрозофилы

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»