WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |

На основанииполученных нами данных были установленыоптимальные режимыинактивации вируса бешенства фенолом: 0,75%концентрация при температуре +20°С в течение 48 ч илипри +37°С в течение 24 ч.

Результаты опытовпоказали, чтоиммуногенность препаратов,инактивированных 0,75% фенолом притемпературе +20°С в течение 48ч, в 2 раза превышает иммуногенностьпрепаратов, обработанныхпри +37°С фенолом в такой же концентрации ииндекс иммуногенности соответственноравнялись 0,68+0,07 и 0,30+0,10 (n=9).

Полученный препаратгемагглютинина обрабатывали -пропиолактоном втех же условиях, что ицельный вирус, учитывая период полураспадапропиолакто-на в водномрастворе (при +37°С 24-32 мин, +25°С 210 мин, +4°Сот 16 до 20 часов), -пропиолактон в максимальнойконцентрации 1:2000 при темпера­туре +37°С винтервале 15-120 минут не влиял наГА-активность гемагглютинина, котораяоставалась на уровне исходной. Приинактивации вируса в условиях температуры +4° и +20°Стакже не наблюдалось потериГА-активности белковогокомпонента в течение всего сроканаблюдения. Ранее мыустановили, что используя -пропиолактон вконцентрации 0.05% (1:2000), можнополучить неинфекционные и иммуногенныепрепараты вируса бешенства.

На основанииполученных данных мы предположили, что-пропиолактон, используемый дляинактивации вируса бешенства в макси-мальной концентрации 0.05%,взаимодействует с основаниями РНК, лишаятем самым вирус инфекционности. Былипроведены опыты по выяснение взаимодействия -пропиолактона с пуриновыми ипиримидиновыми основаниямиРНК: аденозином, гуанозином, цитидином иуридином.

Контроль за ходомреакции осуществлялихроматографически и спектрофотометрически(по изменению характера спектра реакционной смеси вовремени) при длине волны 200-350 нм. В качестве контрольного спектра использовали спектрнемодифицированного аденозина.

Для характеристикипродукта реакции -пропиолактона с аденозиномполу­ченноевещество выделяли методом препаративнойтонкослойной хроматографии в системах А, Ви С. Веществохарактеризовалось хроматографической подвижностьюRf на SiО2.

-пропиолактон инактивируеткультуральный вирус бешешнства полностью инеобратимо. На выделенный структурныйкомпонент вируса бешенства – гемагглютинин, ответственный заиммуногенность, -пропиолактон не оказывает влияния.Он взаимодействует с пуриновыми ипиримидиновыми основаниями вирусной РНК.Изменения в РНК, вызываемыевзаимодействием -проипиолактона с основаниями,приводит к ее инактивации.

2.2.8. Биологические свойствакультурального вируса бешенства

В настоящей работепредставлены результаты изучениябиологических свойствкультурального вируса бешенства,репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, штамм Щелково-51вируса: гемагглютинирующие (ГА), комплементсвязывающие (КС),преципитируюшие (Пр) и иммуногенные (Им), атакже влияния таких физико-химическихфакторов, как обработка вируса ферментами РНК-аза, трипсин и рНсреды.

Для сохранениябиологических свойств вируса бешенстваоптимальными являются пределы рН 6,0-8,0.Вирус обладает комплементсвязывающейактивностью при рН 6,0-8,0, гемагглютиниру-ющей - при рН 3,0-9,0, преципитирующей - прирН 5,0-9,0.

Препараты вируса обрабатывали трипсином вконцентрации 0,05, 0,10 и 0,15% и РНК-азой вконцентрации 0,05, 0,02 и 0,01%. Инкубациюпроводили 30минут при +37 С. Затем вобработанных ферментами препаратах вирусаопределялититр инфекционности, комплементсвязывающей, гемагглютинирующей и преципитирующейактивности.

Трипсин и РНК-аза оказывают влияние наинфекционность вируса бешенства. Трипсин вконцентрации 0,05%практически не снижает инфекционностьвируса. С повышениемконцентрации фермента до 0,10% титринфекционности снижается на1,75 lg, а при обработке вируса 0,15% трипсиномпроисходит снижение его до 0.РНК-аза существенно снижаетинфекционность в пределах более 2 lg (с 6,25 до 4,00 lg) при всех изученныхконцентрациях.

Оба эти фермента невлияют на его гемагглютинирующую ипреципитирующую активность. РНК-аза неснижает также икомплементсвязывающую активность, в то время кактрипсин разрушает ее.

2.2.9. Очистка Ig

Иммуноглобулин G из сыворотки кровиживотных выделяли осаждением 33 % сернокислымаммонием. Полученную глобулиновую фракциюсывороткиобессоливали гельфильтрацией на сефадексеG-25 в колонке К26х70, уравновешенным 10 мМ трис-HCI буфером, рН8,0.

Выход фракцийконтролировали спектрофотометрически пооптической плотности при длине волны=280 нм(ОП280) иобъединяли фракции с ОП280 больше 1,0. Затемобъединенные фракции наносили на DEAE-Toyopearl 650 М,уравновешенный 25 мМ трис-HCI, рН 8,3 (колонка К26х40).

Выход иммуноглобулинаG КРСопределяли, исходя из величины ОП280 объединенногоэлюата, по формуле:

ОП280

Выход IgG в мг = Vх--------,

1,31

где V – объемобъединенного элюата;

ОП280– оптическаяплотность объединенного элюата;

1,31 – экстинкцияраствора IgG сконцентрацией 1 мг/мл.

Выход очищенногоиммуноглобулина составил 160 мг/мл. ЧистотупрепаратаIg G проверялидиск-электрофорезом в полиакриламидномгеле – 7,5 % втрис-HCIбуфере, рН 8,3.

Однородность испецифичность проверялииммуноэлектрофорезом в слое 1 % агара«Дифко» на веронал-мединаловом буфере, рН8,6.

Преципитирующуюактивность определяли по Оухтерлони.Полученныйнами препарат давал полосу преципитации вразведении 1:256-1:512 и выше.

Таким образом, методомионообменной хроматографии, полученвысокоочищенный препарат Ig G КРС, необходимыйдля последующей гипериммунизации кроликов,с целью получения антисыворотки к Ig G КРС.

2.2.10. Разработка методаопределения токсичности масляныхадъювантов и их компонентов

При исследованиитоксичности различныхмасляных адъювантов и их компонентов спомощью разработанного намиспособа в сравнении со способом сиспользованием белых мышей,как более близкого к количественномуспособу оценки токсичности. В результатепроведенныхисследований получилирезультаты токсичностиразличных масел, эмульгаторов и эмульсий,используемых в производстве биопрепаратов, на белых мышах икультуре клеток СП, представленных втаблицах 7-9.

Таблица 7

Токсичностьэмульгаторов при исследовании на мышахи культуре клеток вмонослое

Наименование

Результаты оценки намышах

ТЦД50/мл

пп

эмульгатора

АПМТ, г


ОПМТ,%

накультуре

клеток (lg)

1

Ланолин

6,6±0,4

70,2+4,5

2,1+0,2

2

Сорбитанололеат

6,1+0,3

59,4+3,2

3,4+0,1

3

Монтанид 888

7,1 ±0,4

75,5+4,3

1,6+0,1

4

Монтанид 103

7,3+0,4

77,7+4,3

1,5+0,1

5

Физ. раствор (контроль)

9,4+0,5

100,0±2,0


Таблица 8

Результатыреактогенности масла на мышатах и еготоксичность на культуреклеток в монослое

№ пп

Наименование

масла

Процент отека опытныхлап (М+m), n =5

На культуре кле-ток СПТЦД50 (lg)

1

2

3

4

1

Вакцинное

83,0+2,0

1,8±0,2

2

Основа РМ

155,0+10,0

3,1+0,3

1

2

3

4

3

Основа АМГ-10

165,0+7,0

3,4+0,3

4

Ангарское

80,0+2,0

1,7+0,2

5

Маркол 52

31,0±4,0

1,1±0,1

Таблица 9

Результатыреактогенности масляных компонентов вопыте на мышах и ихтоксичность на культуре клеток СП

№ пп

Наименование

компонента масло+эмуль-

гатор

Соотношение компонентов вадъюванте, %

Процент отекаопыт­ных лапмышей (М + m, n = 5)

ТЦД50 lg

на культуре клеток СП

1

Ангарское Монтанид 103

90

10

68,0+5,0

1,6+0,1

2

Ангарское Ланолин

85

15

68,0±4,0

2,0+0,2

3

АнгарскоеСорбитанолеат

90

10

83,0+6,0

3,1+0,3

4

Маркол 52 Монтанид 103

90

10

40,0+4,0

1,4+0,1

5

Маркол 52 Ланолин

85 15

41,0+4,0

1,8+0,2

6

Маркол 52 Сорбитанолеат

90

10

46+3,0

3,0+0,3

Из полученныхрезультатов этих исследований видно, чтомежду двумя способами оценки токсичности масляных адъювантов иих компонентов, с использованием белых мышек и культуры клеток СП впробирках с монослоем, существуеткорреляция. Причем способоценки токсичности с использованиемкультуры клеток СП в монослое в пробирках на один-двапорядка чувствительней, чем в случаеисследований на белыхмышках.

2.2.11. Получениеспецифических гипериммунных сывороток дляизготовления диагностикумов сиспользованием подобранных адъювантов потоксичности, которую определяли накультуре клеток

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»