WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |

lg LD50/мл

ПТ-80

ИРТ

5

1:512

6,9+0,2

ПГ-3

5

1:563

7,4+0,1

ВНК21/13

бешенства

7

1:512

6,3+0,2

Результатысвидетельствуют о высоком накоплениивирусных антигенов, полученных прикультивировании в биореакторахсуспензионным способом.

2.2.5. Культивирование пастерелл,гемофилл и стрептококков вбиореакторах

В работе использовалипроизводственные штаммы Pasteurella multocida А-1231, В-681 и Д-Т-80,Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae №5870 и ГУ-19, Streptococcus zooepidemicus П-2082 и Streptococcus suis"Касли", Salmonella typhimurium № 415 иSalmonella choleraesuis № 370. Питательные среды длявыращивания вакцинных штаммов готовили подей­ствующиминструкциям на монопрепараты, а ихвыращивание осуществляли поразработанным нами режимамкультивирования в лабораторных фермен­терах АНКУМ-2М,оснащенных системами автоматическогоконтроля и регу­лирования основных параметровкультивирования (температура, рН, еН ирО2).

В процессе работыкультуры пастерелл, гемофильных бактерий истреп­тококков исследовали по следующимпоказателям: морфология, культуральныесвойства, оптическая плотность.

Культуры гемофильныхбактерий инактивировали формалином вко­нечнойконцентрации 0,2% при температуре 18-22°С втечение 5-6 суток и концентрировали доконцентрации 20 млрд.м.т/мл методомцентрифугирова­ния.

Культивированиепастерелл (P.multocida серовариантов А (шт. 1231), В (шт.681) и Д (шт. Т-80)) проводилиреакторным способом на Щел­ковскомбиокомбинате в соответствии с режимом,разработанным сотрудни­ками отделамикробиологии ВНИТИБП.

Штамм P. multocida 115-й,получен­ныйиз ВГНКИ, культивировали вусовершенст­вованной питательной среде наоснове перевара Хоттингера (ПХ).

Концентрация культурпроизводственных штаммов по окончаниипро­цессавыращивания (10-12 час) была 22 ± 2млрд.м.т./мл.

Культуры пастереллинактивировали формалином в конечнойконцен­трации 0,3% при температуре 37°С втечение 24 часов и концентрировали ме­тодомцентрифугирования на центрифуге ОТР 101 - К1при q =12000.

В таблице 5 и на рисунке1 представлена динамиканакопления H.pleuropneumoniae (шт. 5870 и ГУ-19) в процессе культивирования.

Таблица 5

Динамика накопления гемофилъных бактерийв процессе

культивирования (n = 3)

Времякультивирования (час)

Концентрация микробных клетокмлрд.м.т./мл

шт. 5870

шт. ГУ-19

1

2345678

0,7 ± 0,2 1,0±0,1

4,5 ±3,6 7,4± 2,0 9,3 ± 0,2

10,4 ±0,9

10,7±0,7

10,7±0,7

0,5±0,1

0,9 ±0,1

1,8±0,3

6,7±1,2

9,7±1,6

11,9±2,1

11,9 ±2,1

11,9 ±2,1

Фаза логарифмическогороста начинается с 2-х часов изаканчивается к 5-ти часамкультивирования. К 6-7 часам культурывступают в стационарную фазу роста.

14

12

10

8

62-

4-1

2

0

1 2 34 5 6 78

Рис. 1. Динамика накопления гемофил штаммГУ-19 (1) и штамм 5870 (2) в процессе культивирования.

Культуры штаммов 5870 иГУ-19 имели типичную для своего видамикроорганизмов морфологию, культуральныеи биохимические свойства. У гемофильныхбактерий наблюдали выраженнуюкапсулу.

Результатыисследований отражены в табл. 6, из которойвидно, что при управляемом поеН, рН, рО2 иконцентрации глюкозыкультивировании длительность фазыприспособления как пооптической плотности, так и по количествуживых бак­терий значительно короче,максимальная удельная скорость роста выше, чем при культивированиипо методике выращива­ния пастерелл, предложенной ВНИВИП(контроль). Макси­мальное накопление жизнеспособныхбактерий при управляе­мом выращиваниинаблюдалось через 8 ч роста (по методике ВНИВИП - через 10-12 ч) и составило всреднем: 38,4 млрд/см3, что почти в З разавыше максимального накоп­ления, полученногопри контрольном режиме выращивания (13,7 млрд/см3). Изучение морфологии иультраструктуры пастерелл по­зволило сделатьвывод о наличии коррелятивных связеймежду режимом,продолжительностью культивирования ианатомическимиособенностями микробных клеток в по­пуляции.

Культуральные ибиохимические свойства были типичнымидля пастерелл штамма 115: при росте вбульоне наблюдалось равномерное помутнение среды, на агаре -мелкие просвечи­вающие колонии. На средах

Таблица 6

Показатели процессапериодического культивирования пастереллштамма № 115

Условия культивирования

Показатели

Продолжительность фаз роста,ч

Максимальная удельная ско-ростьроста, ч-1

Максимальное накопление,млрд/см3

лаг-фаза

оп

живыемикр.кл.

оп

живыемикр.кл.

оп

живыемикр.кл.

оп

живыемикр.кл.

Усовершенствованная питательнаясреда на основе ПХ и экпериментальныйрежим

Среднее значение

Контроль (методикаВНИВИП)

Среднее значение

1,00

0,25

0,60

0,55

0,60

2,25

2,35

2,30

1,00

1,00

2,00

1,75

1,44

2,40

1,90

2,15

3,25

3,25

3,05

3,05

3,15

3,50

2,90

2,15

3,50

3,00

2,70

2,00

2,80

4,10

3,55

3,82

1,20

1,38

1,23

1,35

1,29

0,92

1,15

1,03

1,68

1,47

1,73

1,61

1,62

1,15

1,15

1,15

1,25

16,50

20,50

16,40

16,16

4,75

4,80

4,81

42,10

42,10

48,90

20,60

38,40

16,50

10,90

13,70

Гисса отмечаласьферментация глюкозы,сахарозы, сорбита, маннита без образованиягаза и отсутствиеферментации лактозы. Пастереллыобразовывалииндол и сероводород.

С целью повышенияпродуктивности процесса получения бактери­альной массы использовали непрерывное(хемостатное) культивирование.

Условиякультивирования - температуру, рН ирО2поддерживали на оптимальных, ранее определенных намиуровнях.

При другом режимевыращивания (скорость разбавления - 0,7 1/часи So= 3 г/л) культура пастерелл была''растущей", более крупной, чем при скорости разбавления 0,4 1/час, восновном, эллипсоидной формы.

Во всех исследованныхрежимах непрерывного культивированиярост пастерелл быллимитирован глюкозой, а биохимическиесвойства со­ответствовали паспортнымданным.

После 4 чкультивирования сальмонелл шт. ТС-177 поранее действовавшей НТД наблюдалась фазазамедления роста. После подключениямембранногобиологического реактора (МБР) концентрацияжизнеспособных сальмонелл возрастала ещена протяжении 8 ч. Выращиваниекультивирования позволяло продлить рост иувеличить накопление жизнеспособныхсальмонелл в 3-4 раза.

После этого в МБРподдерживался оптимальный режимкультивирования, что позволило еще на 4 чпродлить активную фазу роста и увеличитьконцентрациюжизнеспособных сальмонелл еще более чем в 7раз. Коэффициент разбавления питательнойсредой при этом поддерживался в пределах0,5-0,7 1/ч.

2.2.6. Современныеоборудование и методы очистки иконцентрирования питательных сред,антигенов, вирусов и микроорганизмов

Использовалисьвысокоэффективные аппараты дляразделения, очистки и концентрированияполидисперсных жидких систем методамисепарирования, центрифугирования,фильтрования и ультрафильтрования.Использованыновые жидкостные сепараторы иосадительно-фильтрующие центрифуги набесприводной основе с высокимитехнико-экономическими показателями.Теоретически и практически подтверждено,что применение фильтрующих перегородок вроторе и осадительно-фильтрующейцентрифуги исепаратора-разделителя позволяет улучшитькачество разделения жидких биологическихсистем.

Очистка иконцентрирование на примере вирусабешенства и инфекционного ринотрахеита

При проведениифизико-химических исследований структурывирусов, создания диагностикумов,получения специфических антисывороток,проведениягенно-инженерных работ необходимыочищенные и концентрированныепрепараты.

С целью определенияоптимальных условий очистки иконцент­рирования культурального вирусабешенства был испытан ряд мето­дов.

Определяли условияосаждения вируса ПЭГ с молекулярной массой1000, 3000, 6000 и 20000 Дальтон в различныхконцентрациях: 2,5, 5,0, 7,5 и 10,0.

Для концентрированиявируса применяли метод ультрафильтрации,позволяющий свести к минимумунеобходимость использовать дорогостоящееоборудование. Он дает возможность работатьс большими объемами вирусного материала.Метод основывается на отделение вируса откультуральной жидкости с помощьюполупроницаемых мембран с определеннойстепенью пористости.

Наиболее широкоприменяемым способом получения вирусов вчистом виде является центрифугированиедифференциальное, равновесное и вградиенте плотности. При высокоскоростномцентрифугировании 90 тыс.g. полное осаждениевируса происходило за 6 часов.

Для концентрированиявируса бешенства использовали равновесноецентрифугирование на «подушке»сахарозы(55%), хлористого цезия (22%) иглицерина (80%). Проводили центрифугированиепри 161 тыс.g на ультрацентрифуге в течение 4ч.

На основании полученныхрезультатов была составленна схемаполучения очищенных и концентрированныхпрепаратов вируса бешенства. Попредлагаемой схеме очистки иконцентрирования вируса бешенства удаетсяполучить высокоочищенный на 99,99%вирус.

Для получения очищенныхи концентрированных препаратов вируса ИРТКРС были испытаны те же принципы выделениявирусов из суспензий.

Результаты полученыаналогичные как при выделении вирусабешенства.

2.2.7. Инактивация вирусабешенства

В работе былиспользован вирус бешенства, штамм«Щелково-51», репрдуцированный в культуре клетокВНК-21/13. Вирусинактивировали при различной температуре,фенолом и -пропиолактоном.

Термическаяинактивация

Прогревание при+560С оказываловлияние на гемагглютинирующую активностьвируса. Через 3 ч после начала обработкититр гемагглютинирующей активностиснижался с 1:16 (в исходном вирусном материале) до 1:12. К 4-му часуинактивации он снижался в 2 раза (до 1:8) и далее к 5-му часу - до 1:4. Накомплементсвязывающую и преципитирующую активности прогреваниепри температуре 56°С в течение 6-ти часов не оказывало влияния.Биологические свойства вируса, помещенного в условия температуры62°С, проверяли через 5, 10, 15 и 30 минут и далее через каждые 30 минутдо 4 ч инкубации, а затем через 5 и 6 часов с момента начала обработки.Было установлено, что в результате воздействия температуры 62°Синактивация вируса шла быстрее, чем при56 С. Уже через 45 минут происходилаполная потеря инфекционности вируса бешенства. Кроме того,наблюдалось резкое снижение гемагглютинирующей активностипрепарата. Титр гемагглютинирующей активности снижался с 1:16 в исходномвирусе до 1:4 в прогретом препарате. При дальнейшем прогревании титргемагглютинирующей активности постепенно снижался и к 210-240 минутепосле начала обработки был равен 0.Комплементсвязывающая ипреципитирующая активностивируса в течениевсего опытаоставались неизменны.

Как видно изприведенных данных, скорость тепловойинактивации препаратов культуральноговируса бешенства зависела от температуры.

Химическаяинактивация

При изучении влиянияфенола на комплементсвязывающую активность вирусабешенства было установлено, что активность вируса в этой реакции,по сравнению с инактивированным вирусом, втечение 72 ч не изменялась при +4°С. С повышением температуры до 20°Счерез 24ч инкубации наблюдалось снижениетитра комплементсвяывающейактивности в 2 раза. Через 48 и 72 чдальнейшего понижения титране наблюдалось как при +20°, так и при +37°С.

Концентрация фенола итемпература инактивации невлияли на титры гемаггрлютинирующийактивности вируса бешенства. Титры сохранялись впределах 1:12-1:16.

Титр преципитирующейактивности оказывает влияние увеличение концентрациифенола. Если через 24 ч инкубации при концентрации фенола 0,25% титр неизменялся и был равен исходному 1:28, топри добавлении фенола вконцентрации 0,5%-0,75%- 1,0% титр снижался до 1:10,1:8 и 1:4, соответственно, привсех температурах. Титр преципитирующейактивности, снижающийся с 1:28до 1:4 при обработке 1,0% фенолом в течение 24ч, далее оставалсянеизменным. При обработке препаратоввируса всеми концентрациями фенолапреципитирущая активность снижалась к 72 чдо 1:12-1:4 при всехтемпературах.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»