WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

Для проведенияэкспериментов по суспензионномукультивированию клеточных культуриспользовали газовый стерилизаторпитательных сред ЕТО фирмы Pharmatec (Германия),спиннеры магнитного типа с блокомуправления (t, рН, рО2, рСО2) сперемешиванием фирмы Bellco Biotechnology (США),установка для увеличения клеточнойкультуры фирмы Pharmatec (Германия), счетчикколонии клеток «Bacfronic» фирмы NBS (США), сосудыДюара фирмы Forma Scientific, Ins (США) инизкотемпературный холодильник фирмы FormaScientific, Ins (США), биореакторы АНКУМ-2 (Россия) и«Электролюкс» (Швеция), микропроцессорные управляющиекомплексы «Биоцикл МП01.01»; микроносители Cytodex-3 (НПО «Биолар», г.Олайне) и ВИ-3, изготовляемых во ВНИТИБП поразработанной технологии (Патент РФ №1255026).

В процессесуспензионного культивирования культурмикроорганизмов, клеток и вирусовавтоматически контролировались ирегулировались основные физико-химическиепараметры –температура культивирования (tк) и стерилизациибиореактора, арматуры и трубопроводов, рН,рО2, еН,давление и вакуум.

В процессе исследованийконтролировали стерильность питательныхсред и растворов общепринятыми методами наМППБ, МПБ, МПА и среде Сабуро.

2.2.Результаты исследований

2.2.1. Культивирование культур клеток ивирусов в биореакторах

в суспензии и намикроносителях

Глубинноесуспензионное культивирование вбиореакторе

Управляемоесуспензионное культивирование клеток ПТ-80,ВНК-21/13 проводили в биореакторе емкостью 25л, разработки ИркутскНИИхиммаш в комплектес микропроцессорными управляющимикомплексами «Биоцикл» и ин­дивидуальнымимодулями технологической обвязки иуправления, разработки и изготовленияВНИТИБП и НПО «Промавтометика».

Контроль ирегулирование процесса культивированияосуществлялся по основным техно­логическимпараметрам, приведенным в табл. 1.

Использовалитрадиционные питательные среды. Индекспролиферации клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 былсоответственно 2-4 и 3-6, а накопление клетокв 1 см3 – 0,9-1,3106.

Таблица1

Основные контролируемые ирегулируемые параметрыглубинного

процессовкультивирования клеток животных вбиореакторах

Наименование

параметра

Единица

измерения

Текущее

значение

Допустимые

отклонения

Температуракультивирования

Температурастерилизации

Температура втермостате

Расход воздуха

рН, едрН

Скорость вращения

мешалки

Концентрация СО2

Резерв

еН

рО2

рСО2

Давление вбиореакторе

Давление врубашке

биореактора

Град0С

«

«

об/об мил

об/мин

%

мв

кПа

кПа

ати

ати

37,35

122,00

38,05

0,5-2,0

7,20

45,84

1,16

63,60

16,01

5,71

0,29

0,128

+0,50С

+1,00С

+0,30С

+1%

+0,1едрН

+1%

+0,05

+10 мв

+10 %

+10 %

+5%

+10%

Культивированиеклеток вбиореакторе на микроносителях

При крупномасштабномвыращивании культур клеток и вирусовосновным критерием продуктивностипроцесса является обеспечениефизиологических потребностей культурклеток, которые зависят от применяемогоспособа культивирования. Во ВНИТИБПразработаны процессы крупномасштабногокультивирования клеток в биореакторахразличных конструкций с модулемтехнологической обвязки и блокомавтоматического управления основнымипараметрами (tк, tст, рН,еН, рО2,рСО2, давление,расход воздуха на аэрации и др.). Наавтоматизированных блочно-модульныхустановках отработаны оптимизированныережимы выращивания клетоклинии ПТ-80 на микроносителе «Cytodex»(табл. 2).

Таблица 2

Средняяпродуктивность различныхсистем

п/п

Системыкультивирования

Съем клеток с

1 мл питательной

среды

1

Биореакторс перемешиванием и протоком среды

5106

2

Эрлифтныйбиореактор

5106

3

Биореакторс биофильтром и протоком среды

7106

4

Культивирование в микрокапсулах,микроносителях типа «Cytodex»

107 (перфузия)

5

Биореакторс пористыми ячейками

108 (перфузия)

6

Биореакторс полыми волокнами

108 (перфузия)

7

Мембранныебиореакторы (керамический модуль)

109 (перфузия)

культивирования клетокживотных

Для практическойреализации процесса культивированияклеток животных и вирусов выбран методкультивирования на микрокапсулах имикроносителях.

В результате 5-тикультивирований перевиваемых клеток ПТ-80на микроносителе «Cytodex-3» при среднемвремени культивирования 72 ч средний индекспролиферации был равен 2.

В целях масштабированияпроцессов культивирования стадиюадсорбции клеток на микроносителеосуществляли непосред­ственно вбиореакторах.При отработке промышленнойтехнологической схемыадсорбции клеток на микроносителе в 25 лбиореакторе установлено, что опти­мальной посевнойконцентрацией клеток ПТ-80 является 8-12 кл намикроносителе. Рас­пределение клеток на поверхностимикроносителя в конце стадии адсорбции через 2,5-3часа после добавления в биореакторклеточной суспензии оказалось более равномерным при посевнойконцентрации 10-12 кл на микроносителе. Приэтом количест­во прикрепившихся к микроносителюклеток составляло около 95%. Теоретическирас­считанныйпри такой посевной концентрации индекспролиферации клеток ПТ-80 может достигать6-8, максимальный, полученный в наших опытах,со­ставлял 4,2.

Особое внимание привыборе конструкции биореактора длякуль­тивирования клеток животных ивирусов уделяли харак­теристикам ихконструктивных соотношений, материаламузлов биореактора игидродинамическим условиямкультивирования пригарантированном соблюдении асептических условий придли­тельномкультивировании путем сравнениясуществующих системкультивирования.

2.2.2. Изучение основных факторов,влияющих на гибель клеток при глубинномкультивировании в биореакторах

Гибель клеток являетсяосновной проблемой при глубинномсуспен­зионном культивировании вбиореакторах. Гибель клеток в биореакторе,при прочих равных условиях,может быть вызвана гидродинамическимисилами, которые могут бытьобъяснены влиянием аэрации сиспользованием барботажных устройств. Процесс аэрации являетсянеобходимым для снабжения клетокдостаточных количест­вом кислорода и углекислого газа.Влияние аэрации можно разделить на влияниеса­михперемешиваемых потоков среды иповерхности раздела фаз газ-жидкость.Основ­ныепотоки перемешивания создаются за счетподнятия газовых пузырьков. Кроме влияния потоков приперемешивании, образованииповерхности контактагаз-жидкость и ее разрушениепроисходит в процессе образованияпузырьков при диспер­гировании газа и, соответственно,при переходе пузырька в поток жидкости.Также, разрушение пузырькапроисходит и при образовании пены.

Если пузырькиобразуются в месте барботирования, первоначально они не покрытызащитной пленкой (поверхностно-активныхвеществ-ПАВ). В период образова­ния и подъемапузырьков, ПАВ адсорбируется наповерхность пузырька.

До достижениякритического положения взаимодействиеклеток-пузырьков приводит кнемедленной гибели клеток. Чем большемолекул ПАВ адсор­бируется пузырьком, тем насыщеннейон становится и клетки могут далее бытьадсор­бируемыми пузырьком не будутповрежденными. Адсорбированные клеткимогут передвигаться поповерхности пузырька. Если пузырекполностью насыщен, то новые клетки большене смогут примкнуть к нему, а ужеадсорбированные пузырьком поднимаютсявместе с пузырьком на поверхность, где онимогут затем погиб­нуть, если пузырек лопнет.

Скорость гибели клетокявляется простой линейной функцией отинтенсивности аэрации F/V(F – скорость потокагаза, V –рабочий объем биореактора), для пузырьковдиаметром от 4 до 5,5 мм. Эксперименты побарботированию, при которых варьировалосьвремя пребывания пузырьков в куль­туральной жидкости,четко показали, что гибель клеток вбиореакторе не всегда вызываетсявсплыванием пузырьков. Влияние размерапузырьков и их слияния на скорость гибеликлеток требует дальнейшего изучения.Хорошее защитное действие ПАВ отгидроди­намических напряжений сдвига прибарботировании так же эффективно, как и припе­ремешивании, предлагается вкачестве основного метода и примасштабировании про­цесса выращивания клеточныхкультур в биореакторах.

2.2.3. Культивирование клетоксперматогоний

Предложена и испытаначетырехпериодная системасуспензионного культивированиясперматогоний свиньи.

В первом периодекультивирование осуществлялось в спиннереемкостью 100мл, при коэффициентезаполнения 0,5. Посевная доза клетоксоставляла5-106 кл/мл.

Культивирование вовтором периоде суспензионногокультивирования осуществлялось в спиннереемкостью 200 мл, прикоэффициенте заполнения 0,5. Посевная дозаклеток составляла 109 кл/мл.

В третьем периодекультивирование осуществлялось в спиннереемкостью 500 млпри коэффициенте заполнения0,5. Посевная дозажизнеспособных клеток составила 107 кл/мл.

Прежде, чем приступитьк четвертому периоду суспензионногокультивированиясперматидов, было проведеноконцентрирование их заданной дозы на установке BDF-1 с использованиембиофильтра Sulzer с 1010кл/мл до концентрации5х1015 кл/мл, чтосоответствует приведенной технологической схеме процесса сперматогенезаклеток семенника поросенка. После концентрирования суспензионноекультивирование осуществлялось наспиннере емкостью 1000 мл, коэффициентзаполнения 0,5. Концентрациясперматидов составила 5x1015 кл/мл.

Контролируемыми ирегулируемыми параметрами явились:температура культивирования, скорость вращениямешалки, рН, еН, рО2, рСО2 и концентрация сперматогоний. Алгоритм управленияприведен в табл. 3.

Наиболее сложным иопределяющим является четвертый периодсперматогенеза в культуральнойсистеме.

С целью созданиятрансгенных свиней оптимизированныепараметры культивирования позволялиполучать 5-10% живых клеток, включаясперматогонии, несущие дополнительнуюинформацию.

Таким образом,показана принципиальная возможностьпоэтапного суспензионногокультивирования клеток семенникапоросенка в процессесперматогенеза.

Таблица 3

Алгоритмы управления процессомсуспензионного

культивированиясперматидов

Период

сперматогенеза

Параметр

Уровень

поддержания

Первый период

Температура

рН

еН

рО2

рСО2

35+0,5°С

7,0-7,1+0,01

-200мв+10%

40% нас. + 10%

5%нac. +10%

Второй период

Температура

рН

еН

рО2

рСО2

35+0,5°С

7,2+0,01

-100мв+10%

40% нас. +10%

5%нас.+ 10%

Третий период

Температура

рН

еН

рО2

рСО2

35+0,5°С

7,1+0,01

-200мв+10%

60% нас. + 10%

7%нac.+10%

Четвертый период

Температура

рН

еН

рО2

рСО2

35+0,5°С

7,2+0,01

-200мв+10%

60%нас.+10%

7%нас.+ 10%

Кроме того, работы пооптимизации питательных сред на второмпериоде и особенно на третьем ичетвертом периодах сперматогенеза,осуществляемого нами способом суспензионногокультивирования, являются более сложными итребуют дальнейшего изучения.

2.2.4. Культивирование и накоплениевирусов бешенства, ИРТ, ПГ-3 при глубинномкультивировании в биореакторах

При культивированиивирусов ИРТ, ПГ-3 и бешенства сиспользованием культур клеток ПТ-80 и ВНК 21/13 вбиореакторах по отработанным оптимальнымпараметрам в отделах вирусологии имолекулярной биологии в 2001-2004 гг. былиполучены данные, представленные в таблице4.

Таблица 4

Результатынакопления вирусов при ихкультивировании

в биореакторахсуспензионным способом

Культура

клеток

Вирус

n

Титр в

ИФА

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»