WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |

На правах рукописи

ГРИНЬ

Светлана Анатольевна

СОВРЕМЕННЫЕБИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫИ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПРИПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ВЕТЕРИНАРНЫХПРЕПАРАТОВ

03.00.23 –биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации насоискание ученой степени

доктора биологическихнаук

Щелково – 2008 г.

Работа выполнена воВсероссийском научно-исследовательском итехнологическом институте биологическойпромышленности РАСХН.

Научный консультант кандидат техническихнаук, доктор биологических наук,профессор, заслуженный деятель наукиРФРубан Евгений Александрович

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарныхнаук, профессор Смоленский ВладимирИванович, ВГНКИ

доктор биологическихнаук, профессор Тихонов Игорь Владимирович,МГАВМиБ

доктор ветеринарныхнаук Колбасов Денис Владимирович,ВНИИВВиМ

Ведущая организация– ГНУ «Всероссийскийнаучно-исследовательский институтэкспериментальной ветеринарии Я. Р.Коваленко»

Защита состоится 5марта 2008 г. в 10 часов на заседаниидиссертационного совета Д 006.069.01 приВсероссийском научно-исследовательском итехнологическом институте биологическойпромышленности РАСХН по адресу: 141142,Московская обл., Щелковский р-н, пос.Биокомбинат, п/о Кашинцево.

С диссертацией можноознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Авторефератразослан « » февраля 2008 г.

Ученый секретарьдиссертационного совета

кандидатбиологическихнаукЮ.Д. Фролов

1. ОБЩАЯХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы.Современная биотехнологиязанимает ведущее положение в системебиологических, медицинских, ветеринарных изоотехнических исследований ипредставляет собой современнуюпрогрессивную форму промышленнойтехнологии, основу которой составляютбиологические объекты – человек, животные,растения, микроорганизмы, клетки ивирусы.

Фундаментом современнойбиотехнологии являются микробиология,вирусология, генетика, биохимия, биофизика,технология, приборостроение. Сочетанноеиспользование основных элементовуказанных дисциплин позволяет создаватьпроизводственные системы для выпускабиологических препаратов, предназначенныхдля индикации возбудителей, диагностики,профилактики инфекционных болезней илечения животных (Самуйленко А.Я., РубанЕ.А., 2000).

Основы биотехнологии унас в стране отражены в работахИерусалимским Н.Д. (1963), Работновой И.А. (1957,1974, 1976), Печуркиным Н.С. (1978), Помозговой И.Н.(1979), Дьяконовым Л.П. (1998), Сергеевым В.А. (1983),Бекером М.Е. (1978), Кофаровым В.В. (1979),Басникьян И.А. (1992), Бирюковым В.В. (1985),Рубаном Е.А. (1995, 2000, 2008), Самуйленко А.Я. (2000,2008), Калунянцем К.А. и др. (1987); за рубежом– Monod I. (1942), Aiba S.(1961, 1975), Novick A. (1959), Herbert D. (1958, 1961), Pert S. (1975),Metzner A. (1960), Hamer G. (1982), Janessens J. (1984).

Современныебиотехнологические производствапредставляют собой сложный комплексвзаимосвязанных биохимических,физико-химических и биологическихпроцессов, оптимизация которых возможна наклеточном, популяционном, биоценотическоми аппаратурно-технологическомуровне.

Успехи отечественнойветеринарной науки и практики в проведенииспецифической профилактики инфекционныхболезней связаны с крупными научнымиоткрытиями, сделанными в конце ХIХ и началеХХ столетий (Воронин Е.С., Сюрин В.Н., 2000;Панин А.Н., 2001-2006).

В течение 40 летсотрудниками ВНИТИБП накоплен большойопыт в создании новой высокоэффективнойтехники и биотехнологии получения вакцин,диагностикумов, специфических антигеноввирусного и микробного происхождения,гипериммунных сывороток, методов очистки,концентрирования и инактивациимикроорганизмов и вирусов, выделенииспецифического антигена и методов ихоценки.

Разработанысуспензионные методы культивированиямикроорганизмов, клеток животных и вирусов(Рубан Е.А., Раевский А.А., Соловьев Б.В.,1985-2000).

Обеспечениеживотноводства и ветеринарии эффективнымии качественными препаратами – одна из главныхзадач биотехнологии.

Впервые о получениитрансгенных сельскохозяйственныхживотных сообщили две лаборатории в США иГермании (Hammer et al., 1985; Brem et al., 1985). В обоихслучаях для переноса генных конструкций вэмбриональные линии был использован методмикроинъекции. Этот метод и сегодняостается наиболее широко используемым длятрансгенеза в животноводстве (ЗиновьеваН.А., Эрнст Л.К., 2006).

Таким образом,использование при разработке новых исовершенствование существующихпромышленных биотехнологий производствабиопрепаратов с использованиемсовременного оборудования (биореакторов,сепараторов, разделительных центрифуг,фильтров и т.д.), иммунобиологическихметодов будет способствовать повышению ихэффективности и улучшению эпизоотической,экологической и социальной обстановки встране.

1.2. Цель и задачиисследований. Цель настоящейработы состояла в совершенствовании иразработке современныхбиотехнологических процессов ииммунобиологических методов припромышленном производстве ветеринарныхпрепаратов.

Для достиженияпоставленной цели необходимо было решитьследующие задачи:

1. Разработать сиспользованием современного оборудованияметоды и биотехнологические процессыкультивирования микроорганизмов, клетокживотных и вирусов и репродукции культурклеток (включая сперматогонии сгенетическим вектором нужнойнаправленности.

2. Разработатьсовременные методы полученияспецифических антигенов микробного ивирусного происхождения при производствебиопрепаратов.

3. Разработатьметод определения токсичности иреактогенности масляных адъювантов идругих компонентов на первичнотрипсинизированной или перевиваемойкультуре при промышленном изготовлениидиагностикумов и лечебных сывороток и дляполучения гипериммунных сывороток.

4. Разработатьсовременные биотехнологические процессыпроизводства препаратов (диагностикумов,вакцин, лечебных сывороток) ииммунологические методы их оценки (ИФА,ПЦР).

5. Оценитьэкологическую, экономическую и социальнуюэффективность использования предложенныхметодов и биотехнологий ииммунологических методов.

1.3. Научнаяновизна. Усовершенствованы иразработаны

- биотехнологическиепроцессы и современныеиммунобиологические методы анализа припромышленном производстве ветеринарныхпрепаратов, включающие:

- впервые разработан«Набор для ретроспективнойИФА-диагностики инфекционногоринотрахеита КРС»;

- впервые разработан«Набор для ранней ИФА-диагностикиринотрахеита КРС»;

- впервые разработанметод получения очищенного иконцентрированного вируса бешенства,штамм «Щелково-51», репродуцированного вкультуре клеток ВНК-21;

- впервые разработанметод получения очищенного иконцентрированного вируса ИРТ,репродуцированного в культуре клеток ПТ-80для КРС, изучены свойства вируса иопределены условия и сроки его хранениябез потери биологическойактивности;

- разработаны схемыиммунизации лабораторных животных,обеспечивающие получение высокоактивных испецифических гипериммунных сывороток квирусу ИРТ КРС и анти-IgG мыши сывороток приразработке тест-системы для индикацииантигенов вирусов бешенства и ИРТКРС;

- впервые разработанметод определения токсичности иреактогенности масляных адъювантов напервичнотрипсинизированных культурахклеток при изготовлении гипериммунныхдиагностических и лечебныхсывороток;

- впервые полученагипериммунная сыворотка для созданияпассивного иммунитета у свиней противгемофилеза, стрептококкоза и пастереллезас использованием волов как продуцентов, а вкачестве антигенов бралась культура Pasterellamultocida серовариантов А штамм 1231, В штамм 681 иД штамм Т-80, Haemophilus pleuropneumoniae серовара I штаммГУ-19 и серовара П штамм 5870 и Streptococcus suisсеровара II (штамм Касли);

- впервые изобретенспособ размножения стромальных клеток,сперматогоний, сперматоцитов исперматозоидов, включающий в себя ихвыделение, адаптацию и культивирование внеорганизма, а также интеграцию (вшивание) вних генетического вектора. Размножениеосуществляли в биореакторах поэтапно сиспользованием на каждом этапекультивирования питательных сред всеболее сложного состава, обогащенныхфетальной сывороткой крупного рогатогоскота, энергетическими, гормональными иферментативными компонентами иподдерживанием физико-химическихпараметров на оптимальном для каждогоэтапа уровне. Способ позволяет получитьсперматозоиды с генетическим векторомнужной направленности в промышленныхмасштабах вне организма;

- впервые установлено,что кормление перепелок сбалансированнымрационом с добавлением циалитовзначительно увеличивает выход культурклеток из перепелиных эмбрионов.

Новизна полученныхрезультатов подтверждена 6 патентами, в т.ч.2 заявками (Патент № 2184568 от 10.07.20002г., Патент№ 2196336 от 10.01.2003г., Патент № 2196609 от20.01.2003г., Патент № 2196820 от 20.01.2003г. и Заявки напатент № 2007123692 от 20.06.2007г. и №2007142025 от15.11.2007г.).

1.4. Практическаяценность работы. Результатыпроведенных исследований вошли в НТДпроизводства диагностикумов и лечебныхассоциированных сывороток.

Результаты проведенныхисследований использованы при разработкетехнологии биопрепаратов и включены в 6нормативных документов на изготовление,контроль и применение диагностикумов ИРТ,ПГ-3, бешенства и хламидиоза, ИФА, РСК, РИФ,РДП и ассоциированных сывороток противгемофилеза, пастереллеза истрептококкоза.

Все препараты внедрены впроизводство и ветеринарную практику илипроизводятся и применяются в ветеринарнойпрактике в порядке широкогопроизводственного опыта за период 2001-2007гг.

За период с 2001 по 2007 гг.выпущены для практического применения вАПК России диагностикумы против вирусовИРТ ИФА – 500,бешенства РДП – 3500, РИФ – 4000 и хламидиоза РСК – 15000 наборов.
1.5. Основные положениядиссертационной работы, выносимые назащиту:

1. Результатыусовершенствования и разработкибиотехнологических процессов сиспользованием современного оборудованияи современных иммунобиологических методовпри промышленном культивированиимикроорганизмов, культур клеток и вирусови контроля репродукции вирусов имикроорганизмов при промышленном выпускеветеринарных биопрепаратов.

2. Результатыисследований по использованию припромышленном производстве ветеринарныхпрепаратов современных методов иоборудования для разделения, очистки,концентрирования и инактивациимикроорганизмов и вирусов и выделениеспецифических антигенов и методы ихоценки.

3. По результатам оценкитоксичности масляных адъювантов и другихкомпонентов на первичнотрипсинизированной или перевиваемойкультуре клеток и практическоеиспользование этого метода для получениягипериммунных сывороток в процессеразработки и промышленного выпускадиагностикумов ИФА ИРТ, РДП и РИФбешенства, ИРТ, ПГ-3, хламидиоза иассоциированных лечебных сывороток(гемофилез, стрептококкоз ипастереллез).

1.6. Апробация. Основные материалы диссертациидоложены и обсуждены на Международныхнаучных конференциях - Москва (1999-2001 гг.),Киев (2001 г.); Всероссийскойнаучно-практической конференции - Щелково(2000г.); Всероссийскойнаучно-производственной конференции -Ставрополь, (2000г.); Международныхнаучно-практических конференциях -Покров (2000-2002гг.), Новосибирск (2002 г.),Щелково (2003, 2005, 2006 гг.), Москва (2003, 2006 гг.),Крым (2007 г.); Международной биологическойнаучно-практической конференции – Москва (2000г.);Международных научно-практическихконференциях молодых ученых – Щелково (2001, 2002, 2004гг.); заседаниисекции ветеринарной медицины ибиотехнологии - Щелково (2006-2007гг.); назаседаниях ученого совета ВНИТИБП -Щелково (2000-2007гг.).

1.7. Публикации. По материалам диссертацииопубликовано 68 научные работы, в томчисле 6 патентов (из них 2 заявки напатент) и 3 монографии.

1.8. Объем и структурадиссертации. Диссертацияизложена на 305 страницах и состоит извведения, обзора литературы, собственныхисследований, включающих материалы иметоды, результаты, выводы и практическиепредложения, содержит 28 таблиц и 36рисунков. Список литературы включает 612наименований, из которых 132 отечественных и480 зарубежных. В приложении представленыкопии документов, подтверждающиедостоверность результатов работы, еенаучную и практическую значимость.

В выполнении некоторыхразделов диссертации принимали участиеЛ.К. Эрнст, Е.Э. Школьников, Б.В. Соловьев, В.С.Иванов, А.И Гуславский, Э.Я. Сазанова,сотрудники отделов молекулярная биологияи иммунология и оказывали практическую иконсультативную помощь, за что приносим имсердечную благодарность. Выражаемискреннюю признательность за помощьсотрудникам, перечисленным в качествесоавторов в списке публикаций потеме.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы иметоды

2.1.1. Культуры клеток и эмбрионыптиц. В работе использовалисьперевиваемая линия клеток ПТ-80 (почкителенка) и ТАУЭР, культура клеток ВНК21/13, первичные культуры клеток СП(селезенки поросенка) и семенников,нормальных и обработанных ретровирусом,перевиваемые линии клеток СПЭВ,первичнотрипсинизированные культурыклеток почки, легкого и трахеи эмбрионакоровы. Использовали СПФ-яйцо,производимое на ФГУП «Щелковскийбиокомбинат». Инкубирование яиц проводилив промышленных или лабораторныхинкубаторах.

2.1.2.Животные. Использовалиморских свинок, мышей, кроликов разныхвозрастов, свиней, овец и крупный рогатыйскот.

2.1.3.Питательные среды и растворы.Использовали культуральные среды Игла,Эрла, 199, полную среду Игламодифицированную Дульбеко (ДМЕМ) (Gibco,Панэко), бессывороточная среда Хенкса с 0,5%лактальбумином; сыворотка КРС, фетальнаясыворотка телят и коров (НПО «Вектор»,Панэко). Фосфатно-буферный раствор(ФБР) в различных модификациях готовилипо стандартным технологиям, растворыбикарбоната натрия, трипсина («Дифко»), 2,5%лактальбумин, ферменты, гормоны,полиэтиленгликоль (ПЭГ) разнойконцентрации, физраствор.

2.1.4. Маслаи эмульгаторы. Использовалимасла: вакцинное, ТУ 38101307-72, основы РМ (ГОСТ15819-70) и АМГ-10 (ГОСТ 6794-75), Ангарское, Маркол 52(фирма «Эссо», США) и эмульгаторы: ланолин,ФС 42-2520-88, сорбитанолеат, ТУ 18-16-9-81, Монтанид888 и 103 (фирма «Сеппик», Франция).

2.1.5.Штаммы. Использовалификсированного вируса бешенства штамм«Щелково-51», вируса ИРТ КРС штамм «ТК А»(ВИЭВ) В2, вируса хламидийного штамм«Улетово», культуры Pasterella multocidaсеровариантов А «штамм 1231», В «штамм 681» и Д«штамм Т-80», Haemophilus pleuropneumoniae серовара I«штамм ГУ-19» и серовара П «штамм 5870» иStreptococcus suis серовара II («штамм Касли»),респираторно-синцитиального вируса штамм«Randall», вируса ПГ-3 штамм «3КСМ».

2.1.6. Оборудование, технология итехнологические средства контроля

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»