WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 10 |

Дляиммуногистохимического окрашиванияобразцы тканей рака тол-
стой кишки и пограничных с опухольюучастков слизистой оболочкитолстой
кишки фиксировалив 10% забуференном формалине (рН 7.2),проводили по
спиртам иксилолам, заливали в парафин и готовилисерийные срезы толщи-
ной3-5 мкм, которые наносили на стекла садгезивным покрытием (Polysine
Menzel-Glaser).Срезы депарафинировали и регидратировалипо стандартной
схеме. Длядемаскировки антигенов проводилипредварительную обработку
парафиновых срезов в микроволновомрежиме при мощности 650W 2 раза по
5' с использованиемвосстанавливающего раствора рН 6,0 (фирма«Dako»,
Дания) с перерывом 2' междупроцедурами для охлаждения. Длявыявления
коллагенаIV типадополнительно проводилась обработкатрипсином (фирма
«Dako», Дания) в течение30". Срезы инкубировали с первичнымиантитела-
ми на протяжении18 часов при +4°С. В качестве вторичныхантител и пероксидазного комплексаиспользовали стандартный набор реагентовLSAB + Kit(фирма «Dako», Дания). Для визуализации реакцииприменяли раствор диаминобензидина DAB+ (фирма «Dako», Дания). Ядраклеток докрашивали гематоксилином Майера.Контрольный срез оставляли без первойинкубации.

Оценка реакциипроводилась полуколичественным методом сучетом
интенсивностиокрашивания и количестваантиген-позитивных клеток, кото-
рые в совокупности определялиуровень экспрессии белковых маркеров(вы-
сокий или низкий).Иммуногистохимическая реакцияоценивалась как нега-
тивная («-» - нет реакции),слабопозитивная («+» - <10% окрашенныхкле-
ток),умереннопозитивная («++» - >10% клетоксредней интенсивности окра-
ски) и сильнопозитивная илисверхэкспрессия («+++» - >10% клетоквысокой интенсивности окраски). Длядальнейшего сравнительногоиммуногистохи-
мическогоисследования опухолей выделяли дваосновных уровня иммуноре-
активности: низкий уровень,включающий опухоли с отсутствием реакциии
слабопозитивнойэкспрессией (-/+) и высокий уровень,включающий опухо-
ли сумеренной реакцией и сверхэкспрессиеймаркеров (++/+++).

Для каждого антигенаоценивали тип специфическогоокрашивания,
которыйзависел от локализации продукта реакции вклетках или строме
опухоли. Специфическую реакциюмаркеров в волокнах и клеткахстромы
опухолейрасценивали как позитивную или негативную.Иммунореактив-
ностьколлагена IVтипа выявляли по модели экспрессии белка вбазальных
мембранахопухолей.

Методы определениябиохимических маркеров. Определение био-
химических показателей активностибелковых маркеров в опухоли исыво-
ротке крови больныхраком толстой кишки проведено влаборатории клини-
ческойбиохимии НИИ клинической онкологии ГУРоссийского онкологиче-
ского научного центра им.Н.Н.Блохина РАМН.

Для биохимическогоисследования VEGF и sFasиспользовали образцы
сыворотки крови больных ракомтолстой кишки, включенных висследова-
ние, и вкачестве контроля - образцы сывороткикрови 60 практически здоро-
вых людей (30 мужчин и 30 женщин) ввозрасте 19-70 лет (средний возраст - 61,3±8,6года).

Кровь для определенияконцентрации VEGF и sFas убольных РТК до
началалечения и у практически здоровых лиц бралинатощак из локтевой ве-
ныс 8°° до 9°° часов утра. После свертываниякрови пробирки центрифугиро-
вали при 2500xg в течение 10', сыворотку отбирали ихранили при -20°С до
проведения исследования.

sFas всыворотке крови определялииммуноферментным методом, раз-
работанным в Институтебиоорганической химии им. М.М.Шемякинаи
Ю.А.Овчинникова РАН илаборатории клинической биохимии ГУ РОНЦим.
Н.Н.Блохина РАМН(С.Г.Аббасова и соавт., 1999, 2007).

Концентрацию sFas определяли сиспользованием моноклональных ан-
тител против Fas SA-8 (IgGl-k); (8.8±0.6)xl07, которыесорбировали на
планшетах(Linbro) в 0.05Мкарбонатном буфере (рН 9.6) в концентрации5.0
мкг/мл в течение ночи при4°С. Для инактивации свободных центровсвязы-
вания планшетыинкубировали с 1% раствором бычьегосывороточного аль-
бумина(БСА) в фосфатно-солевом буфере (PBS) (рН7.2) 1ч при 37°С.Затем в
планшеты вносилисыворотки. В качестве положительногоконтроля в каж-
дый планшетвносили последовательные двукратныеразведения полнораз-
мерного рекомбинантного Fas от 40.0 до 0.15 нг/мл.Планшеты инкубирова-
ли 1.5ч при 37°С. После инкубации планшеты 6 разинтенсивно промывали
раствором PBS, содержащим 0.1% Tween 20 («Sigma», США) (буфер дляот-
мывки). Процедуруотмывки далее повторяли после каждойстадии теста.
Послеотмывки в планшеты вносилибиотинилированные моноклональные
антитела против Fas SA-7 (IgGl-k); (9.52±1.4)хЮ8 в концентрации 12мкг/мл
в буфере дляотмывки, содержащем 0.1% БСА. Планшеты сбиотинилиро-
ваннымиантителами инкубировали 2 ч при 37°С илиночь при 4°С. Затем в
планшеты вносили растворстрептавидин-пероксидазы («Amersham») врабо-
чем разведении вбуфере для отмывки. Планшеты инкубировали1ч при 37°С.
Далее впланшеты вносили свежеприготовленныйраствор 0.04% ортофени-
лендиамина в 50мМ цитрат-фосфатномбуфере (рН 5.0), содержащем 0.03%
перекиси водорода. Планшетыинкубировали 15-20' при комнатнойтемпера-
туре до развитияокраски. Реакцию останавливалидобавлением в каждую
лунку 50 мкл 10% серной кислоты,оптическую плотность измеряли подлине
волны 492нм наспектрофотометре MR 700 Microplate Reader(«Dynatech
Labs»). КонцентрациюsFasопределяли по калибровочной кривой,соответст-
вующей каждомупланшету.

Концентрацию VEGF в сывороткекрови больных раком толстой кишки
определяли иммуноферментнымметодом с использованием реактивовфир-
мы «DRG» (США).

Определение uPA, tPA, PAI-1 в опухолипроводили иммунофермент-
ным методом с использованиемнаборов реактивов, разработанных влабора-
тории проф. T.Benraad'a (г. Ниймеген,Нидерланды).

Кусочки опухолевойткани доставляли на льду и сразу жеподвергали
гомогенизациив лаборатории клинической биохимии НИИклинической он-
кологии ГУРОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Передгомогенизацией ткань
тщательно очищали от участковнекроза и жира, взвешивали, а затемизмель-
чали и растирали вжидком азоте. Полученный порошокпереносили в цен-
трифужные пробирки, помещенные вледянную баню и добавляли TED-
буфер (10 мМ Трис-НС1, 1,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМдитиотреитол; рН 7,4), со-
держащий 10% глицерина (по объему),из расчета 1 мл буфера на 100мг тка-
ни. Гомогенат центрифугировали 30'(центрифуга Optima TM-TLC,
«Beckman», США).Надосадочную жидкость (цитозоль)использовали для
определения концентрации белка, ааликвоты по 0,5 мл замораживали впо-
лиэтиленовыхпробирках и хранили при -70°С до определенияконцентрации
соответствующих маркеров (не более1 месяца). Порядок проведенияанализа
был одинаков длявсех наборов: по 0,1мл растворов стандартов(лунки А].2-
Gi-2) и разведенных цитозолейинкубировали при +4°С в течение ночи.Про-
мывали 4 раза идобавляли в лунки по 0,1мл рабочих растворовсоответст-
вующих"фиксирующих" антител. Инкубировали прикомнатной температурев течение 2 часов. Промывалии добавляли в каждую лунку по 0,1млрабочего растворадетекторных антител. Инкубировали прикомнатной температурев течение 2 часов. Промывалии добавляли в лунки по 0,1мл растворасубстрата. Инкубировали втечение 30' в темноте при комнатнойтемпературе. Останавливали реакцию, добавляя вкаждую лунку по 0,1 мл 1М H2SO4.Измеряли оптическуюплотность растворов в лунках при 492/620нм.Измерения проводили на автоматическомуниверсальном ридере для микроплашекELx-SOO фирмы «Bio-Tek Instruments Inc.» (США). Всоответствии с инструкциямипроизводителя, обработку результатовизмерений проводили по формуле Y^a+bX+cX, где X - концентрацияанализируемого белка (нг/мл), a Y -оптическая плотность при492нм. При окончательных расчетахучитывали десятикратное разведениецитозолей и выражали концентрациианализируемых белков в нг/мг цитозольногобелка.

Статистический анализрезультатов исследования. Математический
анализ полученных результатовпроводили с использованием пакетастати-
стических программSPSS 7.0 for Windows и Microsoft® Office Excel 2003.
Рассчитывали среднее значениепоказателей, стандартную ошибкусреднего,
а также ихмедианы. Определение достоверностиразличий частот признаков
в изучаемых группах проводили сиспользованием критерия %. Различияме-
жду показателямисчитались статистически значимыми при <0,05.

Анализпрогностической значимости содержаниямаркеров и построе-
ниекривых выживаемости проводили методомКаплан-Майера [Kaplan E.L.,
Meier P. // J. Am. Stat. Assn. - 1958. - Vol.53. - p.457-481]. Достоверность различий ввыживаемости оценивали с помощью"Лог-ранктеста" ("Log-rank test"). Многофакторныйанализ проводили методомрегрессионного анализа поСох Proportionalhazard (Cox) regression model).На основе данныходнофакторного анализа проведенмногофакторный анализ прогностической значимостикомплекса клинико-морфологических признаков с учетомпоказателей экспрессии биохимических ииммуногистохимическихмаркеров.

Результатыисследования и их обсуждение

Иммуногистохимическиеи биохимические маркеры в опухоли
и сыворотке крови больных ракомтолстой кишки

Содержание ММР-9 вопухоли больных раком толстойкишки.
Экспрессия ММР-9определена в первичной опухоли у 187 больныхраком
толстой кишки.Больные раком толстой кишки по уровнюэкспрессии ММР-9
разделились примерно поровну. Так51,3% пациентов были с низкой экс-
прессией ММР-9 в опухоли и 48,7%пациентов - с высокой экспрессиейэтого
белка. Накоплениефермента в опухоли больных раком толстойкишки про-
исходило вцитоплазме раковых клеток и компонентахстромы вокруг опухолевыхкомплексов (фибробластах, макрофагах,стенках сосудов, лейкоцитарных элементах). Цитоплазматическаяреакция высокой интенсивности часто наблюдалась внизко- и умереннодифференцированныхаденокарциномах толстой кишки, а редуцированнаяили очаговая экспрессия маркера - вструктурах высокодифференцированныхаденокарцином. Как правило,выявлялось гомогенное окрашивание цитоплазмыраковых клеток (рис. 1).

Интенсивностьокрашивания компонентов внеклеточногоматрикса не
была связанасо степенью дифференцировки опухоли изависела от характера
стромы и выраженностидесмопластической реакции.

Экспрессия протеазы внормальных тканях толстой кишки быласлабо-
позитивной.

Рис. 1. Экспрессия ММР-9в структурахумеренннодифференцированной
аденокарциномы толстой кишки(х150).Стрептавидин-биотиновый им-
мунопероксидазный метод. Ядраклеток докрашены гематоксилином
Майера.

Экспрессия фермента вопухолях больных раком толстой кишкизави-
села от рядаклинико-морфологических характеристикзаболевания. В табли-
це 3представлены данные об экспрессии ММР-9 вопухоли больных раком
толстой кишки с учетом основныхклинико-морфологических признаковбо-
лезни.

Отметим, что высокаяэкспрессия ММР-9 выявлена достоверно чащев
опухоли пациентов приIVb стадиирака толстой кишки (в 2 раза), присолид-
ном исолидно-альвеолярном гистологическомварианте строении опухоли (в
2 раза), при низкой степенидифференцировки опухоли (в 4 раза), припро-
растании опухольювсех слоев стенки кишки и врастании вжировую клет-
чатку (в 1,7раза чаще), при наличии инвазии опухоли всосуды (в 4 раза).

Таблица 3.

Экспрессия ММР-9 вопухоли больных раком толстой кишки

с учетом основныхклинических признаков

Признак

Градация

Число

больных

Экспрессия ММР-9

Р

+++/++Высокая

+/-Низкая

Пол

мужской

86

46 (53,5)

40 (46,5)

0,5

женский

101

50 (49,5)

51 (50,5)

Возраст

<60

82

37 (45,1)

45 (54,9)

0,1

60

105

59 (56,2)

46 (43,8)

Стадия

I

3

-

3 (100)

0,001

IIa

9

3 (33,3)

6 (66,7)

IIb

29

11 (37,9)

18 (62,1)

IIIa

11

4 (36,4)

7 (63,6)

IIIb

21

6 (28,6)

15 (71,4)

IVa

9

3 (33,3)

6 (66,7)

IVb

20

16 (80)

4 (20,0)

IVb с р.п.

85

53 (62,4)

32 (37,7)

Гистологический вариант строенияопухоли

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»