Дляиммуногистохимического окрашиванияобразцы тканей рака тол- стой кишки и пограничных с опухольюучастков слизистой оболочкитолстой кишки фиксировалив 10% забуференном формалине (рН 7.2),проводили по спиртам иксилолам, заливали в парафин и готовилисерийные срезы толщи- ной3-5 мкм, которые наносили на стекла садгезивным покрытием (Polysine Menzel-Glaser).Срезы депарафинировали и регидратировалипо стандартной схеме. Длядемаскировки антигенов проводилипредварительную обработку парафиновых срезов в микроволновомрежиме при мощности 650W 2 раза по 5' с использованиемвосстанавливающего раствора рН 6,0 (фирма«Dako», Дания) с перерывом 2' междупроцедурами для охлаждения. Длявыявления коллагенаIV типадополнительно проводилась обработкатрипсином (фирма «Dako», Дания) в течение30". Срезы инкубировали с первичнымиантитела- ми на протяжении18 часов при +4°С. В качестве вторичныхантител и пероксидазного комплексаиспользовали стандартный набор реагентовLSAB + Kit(фирма «Dako», Дания). Для визуализации реакцииприменяли раствор диаминобензидина DAB+ (фирма «Dako», Дания). Ядраклеток докрашивали гематоксилином Майера.Контрольный срез оставляли без первойинкубации.
Оценка реакциипроводилась полуколичественным методом сучетом интенсивностиокрашивания и количестваантиген-позитивных клеток, кото- рые в совокупности определялиуровень экспрессии белковых маркеров(вы- сокий или низкий).Иммуногистохимическая реакцияоценивалась как нега- тивная («-» - нет реакции),слабопозитивная («+» - <10% окрашенныхкле- ток),умереннопозитивная («++» - >10% клетоксредней интенсивности окра- ски) и сильнопозитивная илисверхэкспрессия («+++» - >10% клетоквысокой интенсивности окраски). Длядальнейшего сравнительногоиммуногистохи- мическогоисследования опухолей выделяли дваосновных уровня иммуноре- активности: низкий уровень,включающий опухоли с отсутствием реакциии слабопозитивнойэкспрессией (-/+) и высокий уровень,включающий опухо- ли сумеренной реакцией и сверхэкспрессиеймаркеров (++/+++).
Для каждого антигенаоценивали тип специфическогоокрашивания, которыйзависел от локализации продукта реакции вклетках или строме опухоли. Специфическую реакциюмаркеров в волокнах и клеткахстромы опухолейрасценивали как позитивную или негативную.Иммунореактив- ностьколлагена IVтипа выявляли по модели экспрессии белка вбазальных мембранахопухолей.
Методы определениябиохимических маркеров. Определение био- химических показателей активностибелковых маркеров в опухоли исыво- ротке крови больныхраком толстой кишки проведено влаборатории клини- ческойбиохимии НИИ клинической онкологии ГУРоссийского онкологиче- ского научного центра им.Н.Н.Блохина РАМН.
Для биохимическогоисследования VEGF и sFasиспользовали образцы сыворотки крови больных ракомтолстой кишки, включенных висследова- ние, и вкачестве контроля - образцы сывороткикрови 60 практически здоро- вых людей (30 мужчин и 30 женщин) ввозрасте 19-70 лет (средний возраст - 61,3±8,6года).
Кровь для определенияконцентрации VEGF и sFas убольных РТК до началалечения и у практически здоровых лиц бралинатощак из локтевой ве- ныс 8°° до 9°° часов утра. После свертываниякрови пробирки центрифугиро- вали при 2500xg в течение 10', сыворотку отбирали ихранили при -20°С до проведения исследования.
sFas всыворотке крови определялииммуноферментным методом, раз- работанным в Институтебиоорганической химии им. М.М.Шемякинаи Ю.А.Овчинникова РАН илаборатории клинической биохимии ГУ РОНЦим. Н.Н.Блохина РАМН(С.Г.Аббасова и соавт., 1999, 2007).
Концентрацию sFas определяли сиспользованием моноклональных ан- тител против Fas SA-8 (IgGl-k); (8.8±0.6)xl07, которыесорбировали на планшетах(Linbro) в 0.05Мкарбонатном буфере (рН 9.6) в концентрации5.0 мкг/мл в течение ночи при4°С. Для инактивации свободных центровсвязы- вания планшетыинкубировали с 1% раствором бычьегосывороточного аль- бумина(БСА) в фосфатно-солевом буфере (PBS) (рН7.2) 1ч при 37°С.Затем в планшеты вносилисыворотки. В качестве положительногоконтроля в каж- дый планшетвносили последовательные двукратныеразведения полнораз- мерного рекомбинантного Fas от 40.0 до 0.15 нг/мл.Планшеты инкубирова- ли 1.5ч при 37°С. После инкубации планшеты 6 разинтенсивно промывали раствором PBS, содержащим 0.1% Tween 20 («Sigma», США) (буфер дляот- мывки). Процедуруотмывки далее повторяли после каждойстадии теста. Послеотмывки в планшеты вносилибиотинилированные моноклональные антитела против Fas SA-7 (IgGl-k); (9.52±1.4)хЮ8 в концентрации 12мкг/мл в буфере дляотмывки, содержащем 0.1% БСА. Планшеты сбиотинилиро- ваннымиантителами инкубировали 2 ч при 37°С илиночь при 4°С. Затем в планшеты вносили растворстрептавидин-пероксидазы («Amersham») врабо- чем разведении вбуфере для отмывки. Планшеты инкубировали1ч при 37°С. Далее впланшеты вносили свежеприготовленныйраствор 0.04% ортофени- лендиамина в 50мМ цитрат-фосфатномбуфере (рН 5.0), содержащем 0.03% перекиси водорода. Планшетыинкубировали 15-20' при комнатнойтемпера- туре до развитияокраски. Реакцию останавливалидобавлением в каждую лунку 50 мкл 10% серной кислоты,оптическую плотность измеряли подлине волны 492нм наспектрофотометре MR 700 Microplate Reader(«Dynatech Labs»). КонцентрациюsFasопределяли по калибровочной кривой,соответст- вующей каждомупланшету.
Концентрацию VEGF в сывороткекрови больных раком толстой кишки определяли иммуноферментнымметодом с использованием реактивовфир- мы «DRG» (США).
Определение uPA, tPA, PAI-1 в опухолипроводили иммунофермент- ным методом с использованиемнаборов реактивов, разработанных влабора- тории проф. T.Benraad'a (г. Ниймеген,Нидерланды).
Кусочки опухолевойткани доставляли на льду и сразу жеподвергали гомогенизациив лаборатории клинической биохимии НИИклинической он- кологии ГУРОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Передгомогенизацией ткань тщательно очищали от участковнекроза и жира, взвешивали, а затемизмель- чали и растирали вжидком азоте. Полученный порошокпереносили в цен- трифужные пробирки, помещенные вледянную баню и добавляли TED- буфер (10 мМ Трис-НС1, 1,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМдитиотреитол; рН 7,4), со- держащий 10% глицерина (по объему),из расчета 1 мл буфера на 100мг тка- ни. Гомогенат центрифугировали 30'(центрифуга Optima TM-TLC, «Beckman», США).Надосадочную жидкость (цитозоль)использовали для определения концентрации белка, ааликвоты по 0,5 мл замораживали впо- лиэтиленовыхпробирках и хранили при -70°С до определенияконцентрации соответствующих маркеров (не более1 месяца). Порядок проведенияанализа был одинаков длявсех наборов: по 0,1мл растворов стандартов(лунки А].2- Gi-2) и разведенных цитозолейинкубировали при +4°С в течение ночи.Про- мывали 4 раза идобавляли в лунки по 0,1мл рабочих растворовсоответст- вующих"фиксирующих" антител. Инкубировали прикомнатной температурев течение 2 часов. Промывалии добавляли в каждую лунку по 0,1млрабочего растворадетекторных антител. Инкубировали прикомнатной температурев течение 2 часов. Промывалии добавляли в лунки по 0,1мл растворасубстрата. Инкубировали втечение 30' в темноте при комнатнойтемпературе. Останавливали реакцию, добавляя вкаждую лунку по 0,1 мл 1М H2SO4.Измеряли оптическуюплотность растворов в лунках при 492/620нм.Измерения проводили на автоматическомуниверсальном ридере для микроплашекELx-SOO фирмы «Bio-Tek Instruments Inc.» (США). Всоответствии с инструкциямипроизводителя, обработку результатовизмерений проводили по формуле Y^a+bX+cX, где X - концентрацияанализируемого белка (нг/мл), a Y -оптическая плотность при492нм. При окончательных расчетахучитывали десятикратное разведениецитозолей и выражали концентрациианализируемых белков в нг/мг цитозольногобелка.
Статистический анализрезультатов исследования. Математический анализ полученных результатовпроводили с использованием пакетастати- стических программSPSS 7.0 for Windows и Microsoft® Office Excel 2003. Рассчитывали среднее значениепоказателей, стандартную ошибкусреднего, а также ихмедианы. Определение достоверностиразличий частот признаков в изучаемых группах проводили сиспользованием критерия %. Различияме- жду показателямисчитались статистически значимыми при <0,05.
Анализпрогностической значимости содержаниямаркеров и построе- ниекривых выживаемости проводили методомКаплан-Майера [Kaplan E.L., Meier P. // J. Am. Stat. Assn. - 1958. - Vol.53. - p.457-481]. Достоверность различий ввыживаемости оценивали с помощью"Лог-ранктеста" ("Log-rank test"). Многофакторныйанализ проводили методомрегрессионного анализа поСох Proportionalhazard (Cox) regression model).На основе данныходнофакторного анализа проведенмногофакторный анализ прогностической значимостикомплекса клинико-морфологических признаков с учетомпоказателей экспрессии биохимических ииммуногистохимическихмаркеров.
Результатыисследования и их обсуждение
Иммуногистохимическиеи биохимические маркеры в опухоли и сыворотке крови больных ракомтолстой кишки
Содержание ММР-9 вопухоли больных раком толстойкишки. Экспрессия ММР-9определена в первичной опухоли у 187 больныхраком толстой кишки.Больные раком толстой кишки по уровнюэкспрессии ММР-9 разделились примерно поровну. Так51,3% пациентов были с низкой экс- прессией ММР-9 в опухоли и 48,7%пациентов - с высокой экспрессиейэтого белка. Накоплениефермента в опухоли больных раком толстойкишки про- исходило вцитоплазме раковых клеток и компонентахстромы вокруг опухолевыхкомплексов (фибробластах, макрофагах,стенках сосудов, лейкоцитарных элементах). Цитоплазматическаяреакция высокой интенсивности часто наблюдалась внизко- и умереннодифференцированныхаденокарциномах толстой кишки, а редуцированнаяили очаговая экспрессия маркера - вструктурах высокодифференцированныхаденокарцином. Как правило,выявлялось гомогенное окрашивание цитоплазмыраковых клеток (рис. 1).
Интенсивностьокрашивания компонентов внеклеточногоматрикса не была связанасо степенью дифференцировки опухоли изависела от характера стромы и выраженностидесмопластической реакции.
Экспрессия фермента вопухолях больных раком толстой кишкизави- села от рядаклинико-морфологических характеристикзаболевания. В табли- це 3представлены данные об экспрессии ММР-9 вопухоли больных раком толстой кишки с учетом основныхклинико-морфологических признаковбо- лезни.
Отметим, что высокаяэкспрессия ММР-9 выявлена достоверно чащев опухоли пациентов приIVb стадиирака толстой кишки (в 2 раза), присолид- ном исолидно-альвеолярном гистологическомварианте строении опухоли (в 2 раза), при низкой степенидифференцировки опухоли (в 4 раза), припро- растании опухольювсех слоев стенки кишки и врастании вжировую клет- чатку (в 1,7раза чаще), при наличии инвазии опухоли всосуды (в 4 раза).
Таблица 3.
Экспрессия ММР-9 вопухоли больных раком толстой кишки
