член-корреспондентРАМН, профессор Н.Е.Кушлинский доктор медицинских наукВ.В.Делекторская
Официальныеоппоненты:
доктор медицинскихнаук Н.Ю.Полонская
доктор медицинскихнаукМ.Н. Обушева
доктор медицинскихнаук, профессорЮ.А.Барсуков Ведущая организация: Московскаямедицинская академия им.И.М.Сеченова
Защита диссертациисостоится «____»______________2008г. на заседанииДиссертационного Совета Д.208.071.04 приРоссийской медицинской академии последипломногообразования по адресу: (123995 Москва, ул.Баррикадная,д. 2/1).
С диссертацией можноознакомиться в библиотеке Российскоймедицинской академии последипломногообразования (125445, г. Москва,ул.Беломорская,19).Автореферат разослан «____»_____________208г.
Ученый секретарьДиссертационного Совета
доктор медицинскихнаук,профессорВ.Т.Морозова
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. В последние годы вбольшинстве стран мира,в том числе и в нашей страненаблюдается рост заболеваемостиколоректальным раком(Г.И.Воробьев и соавт., 2005; Hawk Е.Т. et al., 2002; Levin В. et al.,2005). Ежегодно в миререгистрируется около 1 млн. новых случаеврака прямой иободочной кишки (3-й по частоте показательзаболеваемости среди онкологических болезней), а умираетпочти 500 тыс. человек (4-е место по показателюсмертности) (Engstrom P.F., 2000;Parkin D.M. et al., 1999;В.В.Мартынюк, 2000; Н.Н.Симонови соавт., 2000; Н.Н.Трапезников и соавт., 2000).
По прогнозу ожидается,что в XXI веке вРоссии рак данной локализа- ции займет первое место в структуреонкологической заболеваемости (Н.Н.Симонов и соавт., 1997; Н.А.Яицкий исоавт., 2004; Е.М.Аксель и со- авт., 2004). В России ежегодноколоректальным раком заболевают 50тыс. человек (3-е место умужчин после рака легких и желудка и 2-еместо у жен- щин после ракамолочной железы) при ежегодной смертности,равной 35 тыс.
Метастазы являются основнымфактором, отягощающим прогнозколо- ректального рака.Поэтому, внастоящее время проводится активный поискдополнительных маркеров,которые предсказывают высокий рископухолевой прогрессии(В.И.Киселев и соавт., 2005).
В настоящее время бурноразвивается направление молекулярнойди- агностики и оценкипрогноза этих опухолей, а исследованиеособенностей биологического поведения опухолиявляется в настоящее время однойиз наиболее актуальныхобластей онкологии (А.А.Новик и соавт., 2004;Von Kleist S., 2008).Расширяютсявозможности иммуногистохимическоговыявления в клетках колоректального рака и вструктурах внеклеточного матриксаособенностей экспрессии молекулярных маркеров,отражающих специфику биологической активности опухоли(В.В.Делекторская и соавт., 2008; Muller W. et al., 1998;Sarris M. et al., 2001; Ahmed F.E. et al., 2005). Средиопухолеассоциированных протеолитическихферментов ведущую роль играет система активаторов плазминогена,представленная двумя протеазами – тканевым и урокиназнымактиваторами плазминогена (uРА и tPA), а такжеметаллопротеиназнаясистема, состоящая из 25 представителей(Н.Е.Кушлинский и соавт., 2008). Ключевую роль всемействе металлопротеиназ играютММР-2 и ММР-9,функция которых связана с гидролизомколлагена базальных мембран(Е.С.Герштейн и соавт., 2008). uРА и tPA превращаютнеактивный зимогенплазминоген в плазмин, расщепляющий фибрини белки внеклеточного матрикса, а такжеактивирующий ММР-2 и ММР-9. Эти процессыспособ- ствуют разрушениюбазальных мембран и облегчают инвазиюопухолевых клеток. Приэтом важную роль в опухолевой прогрессиииграют и их эндо- генныеингибиторы (TIMP и PAI),которые могут способствоватьпротеоли- тическомудействию ферментов (Gershtein E. et al., 2007). ММР,сериновые протеазы (uPA, tPA) не толькооблегчают опухолевый рост, раковуюинвазию иметастазирование, но и могут являтьсямишенью для противоопухолевой терапии и лечения метастазов(Е.С.Герштейн и соавт., 2007; Mysliwill A.G. et al.,2002; Waas E.T. et al., 2002; Gontero P. et al., 2004).
Основные белкибазальных мембран (коллаген IV типа и ламинин)яв- ляются не толькоструктурным барьером для метастатическогораспростра- нения раковыхклеток, но и важной функциональнойединицей, участвующей вопухолевой прогрессии (Galbavy S. et al., 2002).
При этом деградирующиематрикс протеиназы не толькоремоделиру- ют архитектурувнеклеточного матрикса, но и воздействуютна различные
пути передачи сигнала вклетке, усиливают ангиогенез испособствует укло- нениюопухоли от программы апоптоза (Г.И.Абелев исоавт., 2008). Так, из- вестно,что ключевым проангиогенным факторомявляется VEGF -гликопро- теин,стимулирующий пролиферациюэндотелиальных клеток. Этотфактор усиленнопродуцируется также клетками рядановообразований, способствуя неоваскуляризации опухоли иусилению проницаемости сосудов(Gershtem E.S.et al., 2006; Shin J.E. et al., 2007).
Апоптоз или егоотдельные элементы выполняют важныефизиологи- ческие функции,при этом преодоление апоптоза являетсянеобходимым ус- ловиемуспешного развития опухоли (С.Г.Аббасова исоавт., 2007). Один из механизмов, регулирующих этипроцессы в опухоли, связан сактивностью апоптоз-специфических белковсистемы Fas/FasL (Bennett M.W. et al., 2001; O'Connell J. et al. 2000;Zhu Q. et al., 2005;Song E. et al., 2001).
Относительно недавнополучены первые клинические исследованияпо неоангиогенезу иFas-зависимому апоптозу при солидныхопухолях, в том числе иколоректальном раке (С.Г.Аббасова и соавт.,2007). Показано, что повышенный уровень продукцииключевого активатора ангиогенеза -VEGF и ингибитора апоптоза -растворимого Fas-антигена (sFas) убольных некото- рымизлокачественными новообразованиями можетсвидетельствовать о вы- соком «метастатическом потенциале»опухоли, что являетсянеблагоприят- нымпрогностическим фактором (А.А.Фильченков исоавт., 1999; С.М.Киселев исоавт., 2003). Однако эти данные основаны покана незначи- тельном численаблюдений. Кроме того, не изучалиодновременно факторы ангиогенеза и апоптоза сиспользованием малоинвазивныхбиохимических методовисследования в сыворотке крови, что такжезатрудняет обсуждение представленных в литературерезультатов.
Несмотря на то, чтонакапливается все больше данных онарушениях нормальнойэкспрессии и функционированиямолекулярных факторов при раке толстой кишки, их влияние наклиническое течение и прогноззаболева- ния изученонедостаточно. Многие вопросы, касающиесякорреляции клини- ко-морфологических характеристикопухоли и изменений биологическихпо- казателей,происходящих в процессе прогрессированиярака толстой кишки, нуждаются в уточнении. Этимопределяется актуальность изучениямолеку- лярных критериев,прогнозирующих агрессивность теченияколоректального рака.
Цель работы.
Изучение особенностейэкспрессии молекулярно-биологическихмар- керов внеклеточногоматрикса, ангиогенеза, апоптоза в опухоли,сыворотке крови больныхраком толстой кишки и роли комплекса этихфакторов в оценке прогнозазаболевания.
Задачиисследования.
1. Изучитьбиохимические и иммуногистохимическиеособенности экспрессииММР-9 в первичных опухолях больных ракомтолстой кишки и в прилежащей к опухоли непораженнойслизистой оболочке.
3. Провестисравнительный анализ особенностейэкспрессии фермен- товвнеклеточного матрикса и компонентовбазальных мембран и выявить их взаимосвязь с основнымиклиническими и морфологическимипараметрами заболевания.
4. Провестииммуноферментноеопределениемолекулярно- биологических маркеровнеоангиогенеза (VEGF) иапоптоза (sFas) всыво- ротке крови больныхраком толстой кишки и изучить корреляциюбиохими-ческих показателейс основными клинико-морфологическимипараметрами заболевания.
Провестииммуноферментное определение содержаниякомпонентов системыактивации плазминогена (uPA,tPA, PAI-1) вопухоли больных коло- ректальным раком и изучитькорреляцию биохимических показателей сос- новнымиклинико-морфологическимихарактеристиками заболевания.
Провестистатистическую обработку данных и наосновании много- факторного анализа результатовисследования выделить значимые инезави- симыепрогностические показатели при ракетолстой кишки.
Научная новизна.
Проведенкомплексный клинический, морфологическийи биохимический анализсовременных молекулярно-биологическихмаркеров у больных ракомтолстой кишки, таких как протелитическиеферменты и ком- понентывнеклеточного матрикса, факторынеоангиогенеза и апоптоза.
Обнаружена повышеннаяэкспрессия ММР-9 в ткани опухолибольных раком толстойкишки у 48,7% пациентов. При этом, частотавыявления высо- койэкспрессии белка достоверно повышалась до80% у больных при мета- стазах в печени, при низкой степенидифференцировки опухоли (80%) и при наличии инвазии опухоли вкровеносных сосудах (82,4%).
У 57,2% больных ракомтолстой кишки выявлена низкаяэкспрессия коллагенаIV типа в опухоли, причем частотавыявления низкой экспрессии белка достоверно повышалась упациентов с метастазами в печени(85%), при низкой степенидифференцировки опухоли (76%), привыраженной глу- бинеинвазии в стенку кишки (75%), а также приналичии инвазии клеток ра- ка в кровеносные сосуды (86,3%).
Обнаружено что уровеньключевого активатора неоангиогенезаVEGF в сыворотке крови больных ракомтолстой кишки был достоверно выше по сравнению сконтролем. Причем, достоверно болеевысокое содержание VEGF выявлено в сыворотке крови больныхпри местнораспространенной и IVстадии колоректальногорака, тогда как концентрация VEGF убольных ракомтолстой кишки при I и Па стадиях опухолине отличалась от содержания маркера упрактически здоровых людей.
Содержание маркерадостоверноповышалось при увеличении глубины инвазииопухоли в стенку кишки ипри наличии инвазии опухолив кровеносных сосудах. Содержание VEGF принизкой степени дифференцировкиколоректального рака было достоверно выше, чем привысокой. Одновременно сувеличением концентрацииVEGF в сыворотке крови больных ракомтолстой кишки обнаружено достоверное повышение в опухоли уровнянеблагоприятно высокой экспрессии ММР-9 и одновременнонизкая экспрессия коллагена IV типа.
Впервые обнаружено, чтоsFas выявлялся в 2 раза чаще у больныхко- лоректальным раком посравнению с контролем, а его содержание всыво- ротке кровипрактически здоровых людей было ниже, чем убольных. При этом, уровниsFas в сыворотке крови больных ракомтолстой кишки зависели отстадии заболевания, хотя при I стадии не отличались от содержаниямар- кера у практическиздоровых людей. Достоверно выше былосодержание sFas при значительной глубине инвазии,при наличии инвазии в кровеносныесо- суды, принеблагоприятных уровнях экспрессии белковММР-9 и коллагена IV типа.
Обнаружено, чтосодержание uРА и tPAв ткани опухоли больныхра- ком толстой кишки былодостоверно выше, чем в неизмененнойслизистой. При этом, уровниuРА и tPA вткани первичной опухоли зависели отряда клинико-морфологическиххарактеристик опухоли.
Полученные данныесвидетельствуют о том, что новый подход кпро- гнозированиюклинического течения колоректального ракаоснован на ис- пользованиикомплексного анализа согласованныхизменений экспрессии изученныхмолекулярно-биологических маркеров вопухоли и сыворотке крови больных с целью определениясвязи данных показателей синвазивным иметастатическим потенциалом опухоли, астало быть, и выживаемостьюпациентов. На основанииисследования молекулярно-биологическиххарактеристикколоректального рака разработаныкритерии, позволяющие идентифицироватьслучаи с повышенным риском развитияотдаленных метастазов.
Впервые при ракетолстой кишки изучена корреляция междуэкспрессией белковбазальных мембран, факторовнеоангиогенеза, апоптоза, активностью матриксных металлопротеиназ икомпонентов системы активации плазминогена.Изучение особенностей экспрессии белковыхмаркеров в опухоли и сыворотке кровибольных колоректальным раком позволилоуточнить некоторые патогенетическиемеханизмы прогрессирования опухоли.
Практическаязначимость.
На основе анализанекоторых молекулярно-биологическиххарактери- стик опухолиопределены критерии для выявлениянаиболее прогностически неблагоприятных случаев ипредрасположенности, больныхколоректальным раком кразвитию метастазов. Так, показатели общейвыживаемости больных колоректальным раком при высокомуровне экспрессии ММР-9 впервичной опухоли в 3 разадостоверно ниже, чем при низкой экспрессиибелка, а 5- летняябезрецидивная выживаемость пациентов нижев 1,5 раза. Показатели общей5-летней выживаемости больных ракомтолстой кишки зависели от уровня исходной концентрацииключевого активатора неоангиогенезаVEGF всыворотке крови и при высоких егозначениях (от 800 пг/мл и более), они были достоверно ниже, чем призначении VEGFменее 400 пг/мл. Приэтом, высокий уровеньэкспрессии ММР-9 в первичной опухолибольных колорек- тальнымраком был связан с повышенными исходнымиуровнями VEGFв сывороткекрови. Общая 5-летняя выживаемость больныхколоректальным раком приуровнях sFasв сыворотке крови от 10 нг/мли более была досто- вернониже. Кроме того, обнаружено, чтобезрецидивная выживаемость больных раком толстой кишкидостоверно различалась между больнымипо пороговомууровню 3 нг/мг белка для иРА, 2 нг/мг белкадля tPA и 2 нг/мг белка дляPAI-1. Многофакторный анализ выявилнаиболее неблагоприятные сочетания маркеров при оценкеобщего прогноза рака толстой кишки:ММР- 9-коллаген IV типа, MMP-9-uPA,MMP-9-PAI-1, коллаген IV типа-PAI-lи припрогнозе отдаленных метастазов MMP-9-sFas.
Таким образом,настоящее исследование представляетпрактический интерес дляоценки послеоперационного прогнозабольных раком толстой кишки и выделения группповышенного риска развития метастазов иреци- дивов, требующихдополнительного лечения или болеетщательного динами- ческого наблюдения.
