Испытание препарата настерильность и пирогенность проводилив лаборатории технологии иметодов контроля радиофармпрепаратов ФГУПГНЦ РФ - Институт биофизики и испытательномлабораторном центре ЦНИИэпидемиологии. Все сериипрепарата были стерильнымии апирогенными. Одновременно на кроликах оценивалиреакцию на внутривенное введениепрепарата (срок наблюдения - 48 часов).Экспериментальная оценкафункциональной пригодности и безвредностипрепарата «Альбумин,99мТс» была проведенав той же лаборатории на крысах. Былисделаны следующие выводы:
Препарат «Альбумин,99мТс»достаточное времянаходится в сосудистом русле в количестве,которое позволяет адекватно оценитьобъем циркулирующей крови иплазмы.
По своим фармакокинетическимхарактеристикам РФП «Альбумин,99мТс» неотличается от других препаратов альбумина,разрешенных к клиническомуприменению.
Препарат рекомендуется хранить неболее 4 часов.
Радиофармпрепарат «Альбумин,99мТс» невызывают у животныхнежелательных реакций при внутривенномвведении и является безвредным.
Реагент и РФП «Альбумин, 99мТс» могут бытьрекомендованы для клиническогоизучения.
4. Разработка методованализа субстанции ОЭДФ,реагента
и РФП на основеОЭДФ
Разработана схемахимико-фармацевтического анализа субстанции ОЭДФ,включающая определение следующих показателей: описание,растворимость, подлинность, температураплавления, прозрачность и цветностьраствора, рН 1%-ного раствора, посторонниепримеси, сульфатная зола, тяжелые металлы,остаточные органические растворители,количественное определение,микробиологическая чистота, упаковка,маркировка, хранение,срок годности.
ОЭДФ представляет собойпорошок белого или почти белого цвета.
Субстанция (ОЭДФ) оченьлегко растворима в воде; легко растворима в метиловом иэтиловом спиртах; очень мало растворима вацетоне и эфире.
Для доказательстваподлинности субстанции разработаныметодики: ПМР, ЯМР 31Р; ИК-спектроскопии*. В спектреПМР субстанции ОЭДФ присутствует четкийсимметричный триплет в области = 1,6 ± 0,02 м.д., вспектре ЯМР 31Р– синглет вобласти = 20,38 ± 0,02 м.д.
В ИК-спектре ОЭДФнаблюдаются интенсивные полосы поглощенияв области 1190– 1120 см-1, относящиеся кколебаниям фосфорильногокислорода (Р=О ), в области 930см-1 (s Р-ОH ) и 1030 – 1020 см-1 (asР-ОH ), а также при 960 см-1, ответственные заколебание связей в группах Р-ОН и Р-(ОН)2.
Разработана методикаопределения подлинности ОЭДФ с помощьюбумажной хроматографии посовпадению величин Rf в сравнении со стандартом. Хроматографированиепроводили на бумаге FN 17 1012 см всистеме н-бутанол – пиридин – этанол – вода, взятых по объему в соотношении 1 : 0,5 : 1 : 4,восходящим способом. После проявленияхроматограммы обнаружились пятна ОЭДФ– белые нарозово-коричневомфоне с Rf = 0,77 ±0,02 (n = 9; P = 0,95).
Был проведен элементныйанализ** для субстанции ОЭДФ (две параллельные пробы). Найдено, %:С – 11,31; 11,46; Н– 3,92; 4,17; Р– 30,04; 29,96.Вычислено, %: С – 11,65; Н –3,88; Р –30,06.
Температура плавленияОЭДФ составила 198-199 оС.
1%-ный водный растворОЭДФ –прозрачный и бесцветный.
Значение рН 1%-ноговодного раствора ОЭДФ изменяется от 1,5 до2,0.
Потерю массы привысушивании определяли при нагреваниинавески ОЭДФ массой около1,0 г (точная навеска) до 100-105 оС в сушильном шкафу. Потерямассы при высушивании не превышала0,5%.
Содержание сульфатнойзолы из 1 г (точная навеска) субстанции ОЭДФне превышала 0,01% и выдерживала испытание насодержание тяжелых металлов в зольномостатке – неболее 0,001%.
Поскольку на последнейстадии очистки субстанции ОЭДФ используют ацетон, то быларазработана методика определенияостаточногоорганического растворителя (ацетона)методом ГЖХ*** с использованием внешнегостандарта(ацетонитрила). Содержаниеацетона в препарате– не более 0,5%.
* Методики ПМР и ЯМР31Рразработаны нами совместно с к.х.н.Стручковой М.И. и к.х.н. Игнатенко А.В., Институторганической химии РАН им. Н.Д. Зелинского.Методика ИК-спектроскопии разработананами совместно с к.х.н. Сенявиным В.М.,Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова.
** Элементный анализвыполнен к.х.н. Анисимовой Г.Ф., Институторганической химии РАН им. Н.Д.Зелинского.
Разработана методикаопределения ОЭДФ в субстанции. Методиказаключается в «мокром»озолении субстанции смесьюконцентрированных серной и хлорной кислот дофосфат-ионов с последующим спектрофотометрическимопределением в виде «желтого» фосфорнованадиевомолибденового комплекса (ФВМК).Для доказательства того, что разложениеорганической матрицы идет до фосфат-ионов,в качествестандарта использовали КН2РО4. В процессеработыустановлены: оптимальное времяразложения (30-35 мин.), температура разложения (250-350 С). Подобранынеобходимые для разложения количества прибавляемых кислот(концентрированной серной кислоты – 2 мл, концентрированной хлорнойкислоты – 0,35мл). После разложения фосфат-ионыпереводили в «желтую» форму ФВМК прибавлениемванадомолибденовой смеси.
Установлено, чтоположение максимумов в спектрахпоглощения стандарта(КН2РО4) и ОЭДФ послеразложения совпадает – при 350±2 нм. Графикизависимостиоптической плотности от концентрациифосфора в растворе, с учетом относительныхошибок, линейны и накладываются друг на друга: у = 0,2х ± 0,03; r = 0,9971 (КН2РО4); у = 0,2х ± 0,04; r = 0,9971 (ОЭДФ).Следовательно, разложение субстанциипроисходит полностью до фосфат-ионов.Выполнение закона Бугера-Ламберта-Беера наблюдается в интервалеконцентраций фосфора от1,0 до 3,8 мкг/мл. Молярные коэффициентыпогашения КН2РО4 и ОЭДФ практическисовпадают: 6720±156 л/моль.см (КН2РО4), 6707±92 л/моль.см (ОЭДФ). Пределобнаружения фосфора по данной методике составляет 0,1мкг/мл. Относительная ошибка определенияне превышает± 3,6%. Cодержание ОЭДФ в субстанции – не менее 98,0% и неболее 100,5% в пересчете на сухое вещество.
Исследованастабильность ОЭДФ в процессе хранения.Субстанция ОЭДФ хранится в течение 1 годапри температуре не выше 25 оС без изменения еесвойств (исследования продолжаются).
Характеристики и нормыпоказателей качества субстанции ОЭДФпредставлены в табл. 17.
Реагентпредставляет собой стерильный,апирогенный лиофилизат, состоящий из 10 мг ОЭДФ и 20мкг олова(II), хранящийся в укупоренных и завальцованных флаконах.
С учетом ОСТ «Стандартыкачества лекарственных средств.Основные положения» разработанасхема химико-фармацевтического анализа реагента дляприготовления РФП «ОЭДФ,99mTc». Она включаетопределениеследующих показателей: описание,растворимость, подлинность, прозрачность и цветностьраствора, рН, стерильность, пирогенность,количественноеопределение олова(II) и ОЭДФ, упаковка,маркировка, транспортирование, хранение,срок годности.
По внешнему виду реагент представляетсобой лиофилизат белого или почти белогоцвета. Реагент полностью растворим в 0,9%растворе хлориданатрия в течение 10секунд в этом растворителе иобразуетбесцветный и прозрачныйраствор.
Для установленияподлинности реагента разработаныметодики, позволяющие надежно идентифицироватьего. 1) ИК-спектр испытуемого образца в таблеткес KВr в области от 4000 до 400 см-1 должен совпадать с прилагаемымрисунком спектра по положению полос и ихотносительныминтенсивностям. 2) Цветные реакции: а) пообразованиюсинего комплекса при взаимодействии раствора реагента(в 0,9% хлориденатрия) с СоСl2в щелочной среде;
*** Методикаопределения остаточных органическихрастворителей методом ГЖХ быларазработананами совместно с к.х.н. Хомушку Г.М, НПО«Тайфун» (г. Обнинск).
Таблица 17. Характеристики инормы показателей качества субстанцииОЭДФ
Показатели
Методы анализа
Нормапо
Стандартупредприятия
Описание
Визуальный
Белый или почти белыйпорошок
Растворимость
ГФ XI
Очень легко растворим в воде, легкорастворим в CH3OH,
96% C2H5OH
Подлинность
ПМР
ЯМР 31Р
Спектры испытуемого истандартного растворов должны совпадатьпо положению химических сдвигов и ихотносительным интенсивностям.
ИК-спектроскопия
Элементный анализ
ИК-спектры испытуемого истандартного образцов должны совпадатьпо положению полос и их относительныминтенсивностям.
С – 11,31%; Н – 3,92%; Р – 30,04%.
Цветные реакции
а) по образованию синегокомплекса при взаимодействии ОЭДФ сСоСl2 вщелочной среде;
б) по образованиюжелтого соединения при взаимодействииОЭДФ с Н2О2 имолибдатом аммония в кислой среде.
Прозрачность и цветность 1%-ногораствора
ГФ XI
Прозрачный, бесцветный
рН 1%-ного раствора
ГФ XI,потенциометрический
1,5- 2,0
Температура
плавления, оС
ГФ XI
198– 199
Потеря массы при
высушивании
ГФ XI
неболее
0,5%
Содержание
сульфатной золы
ГФ XI
неболее
0,01%
Содержание
тяжелых металлов
ГФ XI
неболее
0,001%
Посторонние
примеси
Бумажнаяхроматография
Единичной примеси не более 0,5%,сумма примесей - не более 2%
Количественное
определение
Спектрофотометрический
От98,0% до 100,5%
Микробиологическая
чистота
ГФ XI
Изм. 3, категория 1.2
Остаточные органическиерастворители (ацетон)
ГЖХ
не более 0,5%
Условия хранения
Стандарт предприятия
При t 25 °С,
в сухом, защищенном отсвета месте
Упаковка
Стандарт предприятия
По 10 г во флакон из темногостекла.
Маркировка
Стандарт предприятия
На этикетке указываютпредприятие-изготовитель и его товарныйзнак, название препарата на русском языке,количество, условия хранения, номерсепии, срок годности.
Срок годности
Стандарт предприятия
1 год
б) раствор, приготовленный дляколичественного определения олова(II),должен быть окрашен в светло-желтый цвет.
Для определениявеличины рН раствора реагента в 5 мл 0,9% изотонического растворахлорида натрия использовалипотенциометрический метод. Величина рНраствора экспериментальных образцовреагентаизменялась от 2,0 до 3,5.
Разработку методикиопределения ОЭДФ в реагентепредварительнопроводили намодельных смесях, а затем наэкспериментальных сериях реагента.При определении ОЭДФ в модельных смесях,реагенте, как и в субстанции, на стадии пробоподготовкибыло проведено разложение органической матрицыконцентрированными серной и хлорнойкислотами до фосфат-ионов.Подобраны оптимальное времяразложения, температура разложения, количествоприбавляемыхкислот. После разложенияфосфат-ионы переводили в «желтую» формуФВМК прибавлениемванадомолибденовой смеси. Максимумыпоглощения в спектрахрастворов ФВМК (дляКН2РО4, ОЭДФ, модельныхсмесей) совпадают (при 350±2 нм); молярныекоэффициенты погашения также практически совпадают: 6720±156л/мольсм(КН2РО4), 6707±92 л/мольсм (ОЭДФ), 6667±613л/мольсм(модельная смесь). Присутствие Sn(II) вколичестве 20 мкг не влияет на определениеОЭДФ.
Результаты валидацииметодики определения ОЭДФ в модельныхсмесях приведены в табл. 18.