WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 11 |

3. Разработка методованализа реагента и РФП на основеальбумина

Реагент представляетсобой стерильный, апирогенныйлиофилизат, состоящий из 10 мг альбумина и 15 мкголова(II),хранящийся в укупоренных и завальцованныхфлаконах.

На основании ОСТ«Стандарты качества лекарственныхсредств. Основные положения» № 91500.05.001-00разработана схемахимико-фармацевтического анализа реагента«Альбумин,99мТс», которая включает в себяопределение следующих показателей:описание, растворимость, подлинность,прозрачность и цветность раствора, рН,стерильность, пирогенность,количественное определение олова(II) иальбумина, упаковка, маркировка,транспортирование, хранение, срокгодности.

Внешний вид реагента определяливизуально, он представляет собойлиофилизат белого или слегка желтоватогоцвета.

Для испытания нарастворимость использовали 0,9% раствор хлориданатрия, поскольку такой же раствор,содержащий 99мТс без носителя, применяется дляприготовления препарата из реагента.Реагент полностью растворим в течение 10-тисекунд в этом растворителе и образуетбесцветный или слегка желтоватыйпрозрачный раствор.

Для установленияподлинности реагента были разработаныметодики, позволяющие надежноидентифицировать его: подлинностьальбумина устанавливали по методу Лоури,основанном на образовании окрашенныхпродуктов реакции ароматическихаминокислот и цистеина (компонентовмолекулы белка) с реактивом Фолина (ГФ XI),при этом развивается темно-синяя окраскараствора; наличие двухвалентного оловаустанавливали по окрашиванию всветло-желтый цвет раствора комплекса,восстановленного оловом(II), двухвалентногожелеза с о-фенантролином, приготовленногодля количественного определенияолова(II).

Для определениявеличины рН раствора реагента в 5 мл изотоническогораствора хлорида натрия использовалипотенциометрический метод. Величина рНраствора экспериментальных образцовреагента изменялась от 2,5 до 3,5.

Для определения белкаобычно используют две известные излитературы методики. Одна из них основанана светопоглощении водных растворов белкав области 260–300нм с максимумом при 278 нм. Другая методикаоснована на образовании в щелочной средеокрашенного в фиолетовый цвет комплексадвухвалентной меди с пептидными связямимолекулы белка с максимумом поглощения при540 нм.

Разработку методикопределения альбумина в реагентепредварительно проводили на стандартныхрастворах, на модельных смесях, а затем наэкспериментальных сериях реагента.

При определенииальбумина по биуретовой реакции былоустановлено, что соблюдение законаБугера-Ламберта-Беера наблюдается длябиуретового комплекса щелочного раствораальбумина при содержании от 0,2 до 1,8 мгальбумина в 1 мл измеряемого раствора при 540нм. Вычислен удельный показательпоглощения 1% щелочного раствора альбуминас биуретовым реактивом, который составил2,75±0,10 (n=12, Р=0,95) и практически совпадает судельным показателем, известным излитературы.

Было установлено, чтосодержание олова(II) в реагенте от 10 до 60мкг/флакон не влияет на определениеальбумина с помощью биуретового реактива.

Также для разработкиметодики количественного определенияальбумина в реагенте была использованаспособность белков к поглощению излученияв УФ-области спектра. Поскольку нашейзадачей было разработать методикуопределения альбумина в реагенте, которыйкроме 10 мг альбумина содержит 15 мкголова(II), причем рН раствора реагента около2,5-3,5, то предварительно требовалосьустановить зависимость спектра поглощениярастворов альбумина от рН. Установлено,что изменение рН от 2,12 до 6,15 не влияет наположение максимума в УФ-спектрепоглощения водных растворов альбумина(макс= 278 ± 2 нм) и на величину оптическойплотности при макс.

Поскольку технологияприготовления альбуминового реагентапредполагает высушивание растворареагента в лиофильной сушке, былипроведены эксперименты на модельныхсмесях с целью выяснения влияния градиентанизких температур на последующееопределение альбумина. Установлено, чтоградиент низких температур, используемыхпри лиофилизации реагента, не влияет наопределение альбумина (не изменяетположения максимума в спектре поглощения(он остается при 278±2 нм) и величинуоптической плотности).

При определенииальбумина по собственному поглощению вУФ-области было установлено, чтособлюдение закона Бугера-Ламберта-Бееранаблюдается для водного раствораальбумина при содержании от 0,4 до 1,6 мгальбумина в 1 мл измеряемого раствора при 278нм. Вычислен удельный показательпоглощения 1% водного раствора альбумина вмаксимуме поглощения при 278 нм, которыйсоставил 5,45±0,25 (n=20, Р=0,95). Погрешностьспектрофотометрического определения непревышала ±5,0%. Установлено, что содержаниеолова(II) в реагенте от 10 до 60 мкг/фл невлияет на определение альбумина пособственному поглощению вУФ-области.

Результаты определенияальбумина в реагенте с помощью биуретовогореактива и по собственному поглощениюбелка в УФ области представлены в табл.9.

Таблица 9. Результатыопределения альбумина в реагенте с помощьюбиуретового реактива и по собственномупоглощению белка в УФ области


N серии

Найдено альбумина,

мг/фл,

с биуретовымреактивом

Найдено альбумина,

мг/фл,

пособственномупоглощению

23290296

10,5

10,3

10,3

9,9

9,9

9,9

24210498

10,5

10,3

10,3

10,3

9,8

9,9

25190398

10,3

11,2

10,3

10,9

10,7

10,7

27090498

10,2

9,9

10,4

9,9

9,7

9,9

30140598

10,4

10,3

10,4

11,2

11,6

11,0

35211298

10,7

10,7

10,4

9,9

10,8

10,8

36170399

10,5

10,5

9,8

10,6

9,9

10,6

Из таблицы видно, чторезультаты определения альбумина вреагенте с помощью разработанныхспектрофотометрических методикдостаточно хорошосогласуются друг с другом и систинным значением 10 мг (введеннымколичеством альбумина при изготовленииреагента)

Содержание олова(II) вреагенте является одним из важнейшихпоказателей качества. Для определенияолова(II) в реагенте наиболее оптимальным, снашей точки зрения, являетсяспектрофотометрический метод. Дляразработки спектрофотометрическойметодики определения олова(II) вреагенте использовали реакцию, основаннуюна измерении светопоглощения окрашенногоRe(IV)-тиоцианатного комплекса при 353 нм,образующегося в результате восстановлениярения(VII) оловом(II) до Re(IV) c последующимвзаимодействием последнего стиоцианат-ионами с образованиемокрашенного комплекса. Работа былапроведена предварительно на стандартныхрастворах олова(II). Выполнение законаБугера-Ламберта-Беера наблюдается винтервале концентраций олова(II) от 1,6-6,4мкг/мл в измеряемом растворе. Пределобнаружения олова(II) по данной методикесоставляет 0,2 мкг/мл. Относительная ошибкаопределения составляет ±5,2%. Рассчитанныйусловный молярный коэффициент погашения() дляRe(IV)-тиоцианатного комплекса оказалсяравным 15731±815 л/моль·см (n=9; P=0,99).

Разработана методикаопределения олова(II) на модельных смесях.Установлено, что положение максимумапоглощения в спектрах раствороврений(IV)-тиоцианатных комплексов (длястандартных растворов Sn(II) и модельныхсмесей) совпадает; молярные коэффициентыпогашения составляют: 15731±815 л/мольсм (растворыолова(II)), 15324 ± 636 л/мольсм (модельная смесь).Графики зависимости оптической плотностиот концентрации олова(II) в стандартномрастворе (y = 0,12x + 0,01; r = 0,9974) и оптическойплотности от концентрации олова(II) вмодельных смесях (y = 0,12x + 0,01; r = 0,9947) с учетомотносительных ошибок линейны инакладываются друг на друга. Присутствиеальбумина в количестве 10 мг не влияет наопределение олова(II). Результаты валидацииметодики представлены в табл. 10.

Таблица 10. Валидацияметодики определения олова(II) в модельныхсмесях

Валидируемые параметры

Результаты

Точность

Введено олова(II),мкг

Найдено

олова(II), мкг

sr

0,8

0,8 ± 0,1

0,08

2,0

2,1 ± 0,2

0,09

4,1

3,9 ± 0,3

0,03

6,1

6,3 ± 0,3

0,05

8,1

7,6 ± 0,5

0,02

10,0

10,2 ± 0,3

0,03

20,0

19,9 ± 0,2

0,01

30,0

29,9 ± 0,7

0,02

40,0

39,5 ± 0,6

0,02

50,0

49,8 ± 0,6

0,01

Воспроизводимость

Стандартное отклонение s = 0,18

(n = 9; P = 0,99)

Линейность

y = 0,12х + 0,01 (r = 0,9974)

Диапазонлинейности

1,6 – 6,4мкг/мл

Пределобнаружения

0,2 мкг/мл

Полученные данныесвидетельствуют о том, что разработаннаяметодика обладает приемлемыми точностью,воспроизводимостью, поэтому мы ееиспользовали для количественногоопределения двухвалентного олова вреагенте.

Результаты определенияолова(II) в реагенте представлены в табл.11.

Таким образом, разработана простая, точнаяи воспроизводимая методика

спектрофотометрическогоопределения олова(II) в реагенте дляприготовления радиофармпрепарата«Альбумин,99мТс».

Таблица 11. Результатыопределения содержания Sn(II) вэкспериментальных

сериях реагента

N серии

Содержание Sn(II), мкг

Введено Sn(II), мкг

Найдено Sn(II), мкг

3

10,0

8,6; 9,8; 9,2

4

15,0

15,3; 15,5; 15,6

5

15,0

13,3; 13,6; 15,5

6

20,0

18,8; 19,8; 17,3

7

20,0

20,0; 20,4; 21,5

8

20,0

21,5; 19,8; 20,7

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 11 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»