WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Также мы рассчитывали парное отношение: ПО = вПСТ2/ вПСТ1. Это отношение негативно коррелирует с вероятностью высвобождения медиатора, однако механизмы такой парной пластичности до конца не изучены (Zucker R.S. и др., 2002).

Метод высокочастотной стимуляции

Для оценки размера синаптического пула везикул, готовых к высвобождению, а также квантовой амплитуды использовали высокочастотную стимуляцию - 40 стимулов, подаваемых с частотой 20 Гц (см. Kirmse K. и др., J.Neurosci., 2006, №26(16), P.4216-11). Повторяющаяся стимуляция ведёт к высвобождению всех везикул, готовых к высвобождению. В конце стимуляции везикулы высвобождаются, как только они достигают пресинаптической мембраны. Таким образом, с каждым последующим стимулом амплитуда вПСТ уменьшается и к концу стимуляции стремится к квантовой амплитуде (рис.4 А). Для оценки квантовой амплитуды использовали синхронные вПСТ на последние 20 стимулов. Для оценки везикулярного пула, готового к высвобождению, строили график зависимости кумулятивной амплитуды вПСТ от количества стимулов. После 10-20 стимулов кумулятивная амплитуда вПСТ стабилизируется, что выражается в её линейном росте с увеличением количества стимулов (рис.4 Б). С помощью обратной экстраполяции к нулевому стимулу линейного компонента на графике зависимости кумулятивной амплитуды вПСТ от количества стимулов можно определить величину, соответствующую амплитуде вПСТ на первый стимул при 100% вероятности высвобождения медиатора (Q*RRP), т. е. произведение квантовой амплитуды (Q) на размер везикулярного пула, готового к высвобождению (RRP).

Таким образом, использовав среднюю амплитуду вПСТ1, полученных посредством парной стимуляции и поделив её на величину, полученную в результате обратной экстраполяции графика кумулятивной амплитуды, можно рассчитать вероятность высвобождения медиатора: Pr = вПСТ1/ (Q*RRP)

Обработка данных и статистика

Все данные обрабатывали после экспериментов с помощью программы PeakCount V3.2 (программа написана Henneberger C, Институт нейрофизиологии, Берлин). Статистический анализ и последующую обработку проводили с помощью программ Prism v 4.03, Corel Draw 12 и приложений MS Office 2003.

Все результаты представлены, как среднее ± стандартная ошибка среднего (СОС), в скобках указано количество данных (n) и вероятность ошибки (p). Все бары на графиках отображают СОС. Различия между средними значениями тестировались с помощью непарного теста Стьюдента (t-теста). Использование других тестов оговаривается отдельно. Для проверки распределения данных на нормальность использовали тест Колмогорова-Смирнова.

РЕЗУЛЬТАТЫ и их ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика постсинаптических токов в клетках Кахаля-Ретцуса

С помощью patch-clamp метода регистрировали спонтанные ПСТ в клетках-КР. Они имели среднюю амплитуду 71 ± 14 пА и возникали с частотой 0,13 ± 0,05 Гц (n = 6). Эти токи были нечувствительны к DNQX (10 мкМ) и APV (50 мкМ) (блокаторам глутаматных рецепторов) и полностью, но обратимо блокировались бикукуллином (10 мкМ) и габазином (20 мкМ) (блокаторы ГАМКА рецепторов). Таким образом, регистрируемые ПСТ имели ГАМК-эргическую природу.

Далее мы регистрировали миниатюрные ПСТ (минПСТ), добавив 0,5 мкМ тетродотоксина без NEM в проточный раствор (см. методы). МинПСТ в клетках-КР имели низкую частоту 0,07 ± 0,01 Гц (n = 11). Анализируя записи, мы обнаружили наличие двух типов минПСТ, различающихся разной кинетикой нарастания и шумом на фазе спада, но одинаковые по кинетике спада (рис.1 А, Б).

Для увеличения частоты спонтанных минПСТ мы использовали преинкубацию срезов с 50 мкМ NEM (см. методы), что позволило нам провести статистический анализ минПСТ. Распределение времени нарастания (от 10 до 90% амплитуды) минПСТ наилучшим образом апроксимировалось суперпозицией двух функций Гаусса (Рис. 1 В; р < 0,01; F-тест) со средними значениями 0,52 ± 0,04 мс и 1,22 ± 0,05 мс (n = 17; р < 0,001). На основании этого мы разделили минПСТ на токи с быстрой кинетикой нарастания (минПСТб, время нарастания < 1мс) и токи с медленной кинетикой нарастания (минПСТм, время нарастания > 1мс).

Рис. 1. Два типа миниатюрных ПСТ в клетках Кахаля-Ретциуса.

  1. Пример записи минПСТ. На увеличенном фрагменте записи продемонстрированы два последовательных события с разной кинетикой нарастания.
  2. Скалированные по амплитуде индивидуальные минПСТ с быстрой (чёрная линия) и с медленной (серая линия) кинетикой нарастания (верхняя часть рисунка) демонстрируют одинаковую кинетику спада (нижняя часть рисунка).
  3. Распределение времени нарастания (от 10% до 90% от амплитуды) минПСТ оптимально апроксимируется суперпозицией двух функций Гаусса (для данной клетки: 0,5 ± 0,13 и 1,05 ± 0,91 мс; среднее ± стадартное отклонение; n = 320).
  4. Распределение временной константы спада минПСТ оптимально апроксимируется одной функцией Гаусса (для данной клетки: 16,5 ± 4,7 мс; среднее ± стандартное отклонение; n = 280).
  5. Распределение амплитуды минПСТ мономодально, но сильно скошено.
  6. Амплитуда минПСТ не коррелирует со временем нарастания.
  7. Временная константа спада минПСТ не коррелирует со временем нарастания.
  8. Амплитуда минПСТб значимо больше амплитуды минПСТм (белые столбики; ***-p<0,001). Временная константа спада минПСТб и минПСТм значимо не различалась (серые столбики).

Распределение амплитуды минПСТ было мономодальным, но сильно скошенным (рис.1 Д). Медианная амплитуда минПСТб была значимо больше медианной амплитуды минПСТм (24,2 ± 1,6 и 55,1 ± 5,2 пА для минПСТм и минПСТб соответственно; n = 17; р < 0,001, рис.1 З)., более того более быстрым событиям соответствовала большая амплитуда (рис.1 Е).

Последний факт, а также само существование токов с разной кинетикой нарастания можно объяснить эффектом дендритного фильтрования, т. е. более дистально расположенные синапсы должны генерировать более медленные токи с меньшей амплитудой, нежели проксимальные дендриты. Однако распределение временной константы спада минПСТ было нормальным (рис.1 Г) и, более того, не наблюдалось корреляции между временем нарастания и временной константой спада (рис.1 Ж).

Другой возможной причиной, объясняющей наблюдаемые факты, может быть наличие двух типов синапсов на клетках-КР. Для проверки этой гипотезы мы провели анализ шума на фазе спада минПСТ и попытались разделить минПСТ фармакологически.

Разные миниатюрные ПСТ обусловлены разными ГАМКА рецепторами.

Проведя нестационарный анализ шума минПСТ на фазе спада, мы выявили, что разные токи обусловлены постсинаптическими рецепторами с разной средней взвешенной проводимостью одиночных каналов: 34,4 ± 3,9 пСм для минПСТб и 18,4 ± 3,8 пСм для минПСТм (р < 0,001; n = 9).

Далее мы исследовали чувствительность минПСТ к золпидему, аллостерическому модулятору ГАМКА-рецепторов. В зависимости от концентрации золпидем потенцирует ГАМКА-рецепторы с разными субъединицами (Ki в нМ для 1 – 20, 2/3 – 450 и 5 – 15000). В концентрации 100 нМ золпидем специфически модулирует ГАМКА рецепторы с 1 субъединицей. В наших экспериментах 100 нМ золпидема не влияли ни на медианную амплитуду (107 ± 9 % от контроля; p > 0,3; однопопуляционный t-тест), ни на время полуспада минПСТб (109 ± 12 % от контроля; p > 0,2; n = 18; однопопуляционный t-тест; рис.2). В противоположность минПСТб, золпидем значимо пролонгировал минПСТм (время полуспада: 131 ± 9 % от контроля; p < 0,001; однопопуляционный t-тест), но не изменял медианную амплитуду минПСТм (104 ± 6 % от контроля; p > 0,4; n = 18; однопопуляционный t-тест; рис.2).

Рис.2. Модуляция минПСТ золпидемом.

Диаграмма влияния 0,1 и 2 мкМ золпидема (Зол) на амплитуду (ампл.) время полуспада (спад) и вариацию (CV) минПСТ. (*** - p < 0,001; * - p < 0,05 – однопопуляционный t-тест). Все данные были отнормированы к контролю.

В концентрации 2 мкМ золпидем модулирует ГАМКА рецепторы, содержащие уже не только 1, но и 2, 3 субъединицы. В наших экспериментах, 2 мкМ золпидема значимо увеличивали медианную амплитуду (126 ± 5 % от контроля; p < 0,001) и время полуспада минПСТб (166 ± 8 % от контроля; p < 0,001; n = 14; однопопуляционный t-тест; рис.3). В то же время медианная амплитуда минПСТм под действием 2 мкМ золпидема не изменялась (108 ± 9 % от контроля; p > 0,3), тогда как время полуспада минПСТм, как и в случае 100 нМ, значимо увеличивалась (173 ± 10 % от контроля; p < 0,001; n = 14; однопопуляционный t-тест; рис.2). Интересно, что вариация минПСТм (CV = среднее значение /стандартное отклонение), при 2 мкМ золпидема значимо снижалась (88 ± 3 % от контроля; p < 0,05; n = 14; однопопуляционный t-тест; рис.2). Последний факт, а также то, что 2 мкМ золпидема пролонгируют, но не изменяют амплитуду минПСТм, можно объяснить тем, что медленные синапсы насыщаются выбросом медиатора из одной везикулы.

Дальнейшее увеличение концентрации золпидема до 20 мкМ никак не изменяло общей картины эффектов на минПСТ. Основываясь на полученных результатах, мы заключили, что разные минПСТ обусловлены разными постсинаптическими ГАМКА рецепторами в разных синапсах на клетках-КР.

Вызванные постсинаптические токи

Для ответа на вопрос о том, обусловлены ли разные группы синапсов разными проекциями, мы использовали метод парной электрической стимуляции аксонов в маргинальной зоне неокортекса и регистрировали вызванные ПСТ (вПСТ).

Анализ полученных данных показал, что вПСТ также можно разделить на две группы на основании их кинетики нарастания (рис.3 А, Б, В). Быстро нарастающие (< 1 мс) вПСТ (вПСТб) имели среднее время нарастания 0,58 ± 0,02 мс (n = 57), тогда как у медленных (>1 мс) вПСТ (вПСТм) оно составляло 1,24 ± 0,04 мс (n = 18) (рис.3 Б). При этом временная константа спада у разных групп вПСТ значимо не различалась (21 ± 3 и 23 ± 2 мс для вПСТб и вПСТм соответственно). Таким образом, мы заключили, что разные синапсы на клетках-КР образованы отдельными проекциями, мы назвали их быстрыми (генерируют вПСТб) и медленными (генерируют вПСТм).

Для определения источников входов на клетки-КР стимулировали нервные волокна в разных зонах коры. Мы обнаружили, что стимуляция в глубоких слоях кортикальной пластинки и в подпластинке приводит к возникновению только вПСТм, следовательно, медленные проекции являются аксонами ГАМК-эргических интернейронов подпластинки. Локализовать источники быстрых проекций нам не удалось. Вызванные ПСТб возникали исключительно при стимуляции в рамках маргинальной зоны. Поскольку ГАМК-эргические интернейроны в маргинальной зоне не проецируют аксоны на клетки-КР (Soda T. и др. 2003), то мы полагаем, что быстрые входы образованы аксонами ГАМК-эргических нейронов из zona incerta вентрального таламуса (Lin C.S. и др. 1990).

Средняя амплитуда вПСТм значимо не отличалась от амплитуды вПСТб (96 ± 11 и 84 ± 10 пА для вПСТб (n = 57) и вПСТм (n = 18), соответственно; p = 0,53; рис.3 Г). ПО для вПСТб было значимо выше, чем для вПСТм (1,49 ± 0,08 и 1,01 ± 0,05 для вПСТб (n = 57) и вПСТм (n = 18) соответственно; р < 0,01; рис.3 Д). Последний факт может указывать на большую вероятность высвобождения медиатора в медленных проекциях, чем в быстрых проекциях.

Рис. 3. Два типа вПСТ и их свойства.

  1. Примеры записей вПСТ с быстрой (слева) и медленной (справа) кинетикой нарастания, полученные путём парной стимуляции. На верхней части рисунка представлено 20 пар индивидуальных вПСТ, на нижней – усреднённые записи.
  2. Время нарастания вПСТ распределено бимодально.
  3. Сравнение скалированных по амплитуде усреднённых вПСТ с быстрой (чёрная линия) и медленной (серая линия) кинетикой нарастания.
  4. Средняя амплитуда вПСТ на первый стимул при парной стимуляции (вПСТ1) для быстрых (вПСТб) и медленных проекций (вПСТм) значимо не различается.
  5. Отношение средних амплитуд ответов на первый и второй стимулы при парной стимуляции (ПО) для быстрых проекций (вПСТб) значимо больше, чем для медленных (вПСТм). (** - p < 0,01).

Для проверки этой гипотезы мы использовали высокочастотную стимуляцию (см. методы, рис.4 А). Согласно нашим результатам, амплитуда последних вПСТ (т.е. квантовая амплитуда) в быстрых проекциях была значимо больше, чем в медленных проекциях (54 ± 6 и 32 ± 3 пА для вПСТб (n = 22) и вПСТм (n = 10) соответственно; р < 0,05; рис.4 В). Количество везикул, готовых к высвобождению значимо не различалось (12,1 ± 1,5 и 14,4 ± 2,5 для вПСТб (n = 22) и вПСТм (n = 10) соответственно; р < 0,36; рис.4). Рассчитанная вероятность высвобождения в быстрых входах была значимо ниже, чем в медленных (12 ± 1% и 19 ± 1% для вПСТб (n = 22) и вПСТм (n = 10) соответственно; р < 0,01; рис.4 Г). Таким образом, выдвинутая нами гипотеза подтвердилась.

Рис. 4. Параметры рассчитанные с помощью высокочастотной стимуляции.

  1. Пример записи ответов на высокочастотную стимуляцию. На увеличенном фрагменте записи представлены так называемые последние вПСТ, средняя амплитуда которых стремится к квантовой амплитуде (Q).
  2. Принцип определения размера везикулярного пула (RRP), готового к высвобождению, по стабильному компоненту графика зависимости кумулятивной амплитуды вПСТ от количества стимулов.
  3. Квантовая амплитуда (последние вПСТ) быстрых входов (вПСТб) значимо больше квантовой амплитуды медленных входов (вПСТм) (* - р < 0,05).
  4. Количество везикул, готовых к высвобождению (RRP), значимо не различается в быстрых медленных входах.
  5. Вероятность высвобождения (Pr) быстрых входов значимо меньше вероятности высвобождения медленных входов. (* - р < 0,01).

Разная чувствительность входов к внеклеточной ГАМК

ГАМК-эргическая синаптическая передача на клетки-КР тонически подавляется экстраклеточной ГАМК через пресинаптические ГАМКБ рецепторы (Kirmse K. и Kirischuk S., 2006). В связи с этим мы предположили, что разная вероятность высвобождения медиатора в синапсах на клетках-КР обусловлена разной их чувствительностью к внеклеточной ГАМК. Для проверки этой гипотезы мы изучали действие 1 мкМ CGP (блокатор ГАМКБ-рецепторов), 10 мкМ баклофена (агонист ГАМКБ-рецепторов) и 40мкМ SNAP (блокатор ГАМК транспортеров 2 и3 его типов) на вПСТ при парной стимуляции.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»