WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Как следует из приведенных данных, во всех клинических образцах, полученных от 28 больных сифилисом, у которых бледная трепонема не обнаруживалась методом темнопольной микроскопии, но выявлялась ДНК бледной трепонемы методом PCR-tpp47 (группа В), было подтверждено наличие ДНК микроорганизмов рода Treponemа. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК обнаруженного микроорганизма, проведенный методом секвенирования, подтвердил его принадлежность к виду T.pallidum. Возможной причиной расхождения результатов исследования образцов рейц-серума. сифилидов от этих пациентов методами ТПМ и PCR-tpp47 следует считать более высокую аналитическую чувствительность метода ПЦР, а также влияние на результаты ТПМ приема системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, снижающих эффективность обнаружения бледной трепонемы, наличие сопутствующей инфекции (в особенности герпетической).

Во всех 5-ти образцах пациентов группы С, у которых метод ТПМ давал положительный результат, а результаты ПЦР-исследования оказались отрицательными, методом PCR-16S-rDNA было подтверждено наличие в клиническом материале трепонем. Вместе с тем метод секвенирования позволил отнести эти трепонемы к другим видам: T.putidum (у 2-х пациентов) и T.refringens (у 3-х обследованных), что говорило о возможности ошибок диагностики, допущенных врачами лабораторий при проведении темнопольной микроскопии.

Эта группа была представлена двумя пациентами с диагнозом первичного сифилиса и тремя пациентами с диагнозом вторичного сифилиса. При этом, если у больных вторичным сифилисом клинические данные подтверждались результатами серологического обследования на сифилис, то у пациентов с первичным сифилисом результаты как трепонемных, так и нетрепонемных серологических тестов были отрицательными, а диагноз был установлен только на основании клинических данных и положительных результатов ТПМ. Данные ПЦР и последующего секвенирования выделенных ДНК возбудителя подтвердили наличие в клинических образцах этих пациентов Treponema refringens, а не T.pallidum. Кроме того, именно у этих двух пациентов из всех обследованных лиц в материале соскобов с высыпаний на коже была обнаружена ДНК вируса простого герпеса 2-го типа. Возможно, на фоне клинической картины, характерной для сифилиса, мнение специалиста, проводившего микроскопию, о видовой принадлежности наблюдаемых спирохет склонилось в пользу T.pallidum, в то время как причиной эрозивно-язвенных поражений гениталий являлся ВПГ-2. Полученные результаты позволяют считать, что этим пациентам с эрозивно-язвенными проявлениями, вызванными ВПГ-2 и колонизированными сапрофитными трепонемами, на основе результатов ТПМ диагноз первичного сифилиса был поставлен ошибочно, т.е. имела место гипердиагностика первичного сифилиса методом ТПМ.

С учетом результатов исследования окончательная оценка диагностической значимости полимеразной цепной реакции в сравнении с темнопольной микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции осуществлялась на 99 больных сифилисом. При этом чувствительность ПЦР у больных первичным сифилисом составила 100%±0% (чувствительность темнопольной микроскопии – 76,5±10,6%, р<0,05), при вторичном сифилисе - 80,5±4,4% (темнопольной микроскопии – 51,2±5,6%, р<0,001). Общая чувствительность метода ПЦР при диагностике первичного и вторичного и вторичного сифилиса составила 83,8±3,7% (темнопольной микроскопии – 55,6±3,0%, р<0,001). Общее количество случаев гипердиагностики методом ТПМ составило 5% (5человек из 101).

Изучение специфичности метода ПЦР при диагностике сифилиса, проведенное на 118 пациентах группы контроля, позволило подтвердить высокую специфичность метода. При этом результаты ПЦР оказались отрицательными у 116 пациентов и положительными – у 2-х женщин, у которых клинический материал был получен из цервикального канала и на момент обследования отсутствовали клинические проявления сифилиса. При динамическом наблюдении за данными пациентками была отмечена позитивация серологических реакций на сифилис и развились клинические признаки сифилиса. Возможно, в момент обследования клинические проявления инфекции у этих пациенток локализовались в области шейки матки и не были замечены при обследовании. Проведенные исследования позволили расценить специфичность метода ПЦР при обследовании на сифилис, как 100%.

Таким образом, проведенное исследование показало, что результаты метода ПЦР при обследовании лиц с подозрением на сифилис позволяют более объективно по сравнению с микроскопическим методом оценивать как наличие, так и отсутствие возбудителя в исследуемом материале, обеспечивая точность поставленного диагноза. Широкая оснащенность современных диагностических лабораторий оборудованием для проведения ПЦР-исследований и наличие зарегистрированных коммерческих диагностикумов позволяют ставить вопрос о целесообразности включения данного метода в алгоритм лабораторного обследования лиц с подозрением на первичный и вторичный сифилис. В связи с этим следует считать целесообразным применять метод ПЦР при подозрении на первичный и вторичный сифилис, в особенности при отрицательных данных ТПМ, приеме системных и местных антибактериальных и антисептических препаратов, наличии микст-инфекции (в особенности герпетической).

3. Эффективность метода иммуноблоттинга при диагностике ранних форм сифилиса и у лиц, находившихся в половом контакте с больными сифилисом. При обследовании больных первичным сифилисом стандартными серологическими методами наименее чувствительной оказалась РСК с кардиолипиновым антигеном (положительный результат получен в 65±7,6% случаев) (таблица 3.).

Таблица 3. Чувствительность стандартных серологических методов и иммуноблоттинга на ранних стадиях сифилитической инфекции (M±m, %)

Группы пациентов

РМП

РСКт

РСКк

РИФабс

РПГА

ИФА

ИБ

Cифилис первичный (n=46)

88,6±4,9

39/44

87,5±5,3

35/40

65±7,6

26/40

100

40/40

97,4±2,6

37/38

97,7±2,3

42/43

100

46/46

Сифилис вторичный (n=25)

100

25/25

100

25/25

100

25/25

100

25/25

100

25/25

100

25/25

100

25/25

Сифилис скрытый ранний (n=25)

92,0±5,5

23/25

96,0±4,0

24/25

92,0±5,523/25

96,0±4,0

24/25

96,0±4,0

24/25

96,0±4,0

24/25

100

25/25

ЛБПК (n=14)

7±7,1

1/14

0

0

0

0

21±11,3

3/14

36±13,3

5/14

Несколько более чувствительными оказались другие реакции комплекса серологических реакций: РСКт (87,5±5,3%) и РМП (88,6±4,9%). Наиболее чувствительными из серологических тестов оказались трепонемные тесты: РИФабс – 100% и ИФА 97,7±2,3 %. РПГА давала положительный результат в 97,4±2,6%. Чувствительность иммуноблоттинга при первичном сифилисе первоначально была определена, как 97,8 %. При этом у 1 пациента с отрицательным результатом ИБ был выявлен факт неправильного хранения материала пред исследованием, что не исключало возможности получения ложноотрицательного ответа. При повторном обследовании больного с исследованием новой порции крови был получен положительный результат ИБ, что позволило сделать вывод о 100% чувствительности метода ИБ. Положительные результаты иммуноблоттинга регистрировались у ряда пациентов с первичным сифилисом при отрицательных результатах РСКк, РМП или РСКт, а также ИФА и РПГА. При этом чувствительность метода иммуноблоттинга достоверно превышала чувствительность РСКк (р<0,001), РМП (р<0,05) и РСКт (р<0,05).

Таким образом, проведенные исследования позволили сделать заключение о 100% чувствительности метода ИБ у больных первичным сифилисом, превышающей чувствительность нетрепонемных (РСКк,; РМП) и трепонемных (кроме РИФабс) тестов.

У больных вторичным сифилисом результаты всех серологических методов (РСК, РМП, РПГА, РИФабс, ИФА, а также иммуноблоттинга оказались положительными (100% чувствительность), что соответствовало современным представлениям о развитии на вторичной стадии сифилитической инфекции максимального иммунного ответа организма больных к T. pallidum и свидетельствовало о нецелесообразности использовать метод иммуноблоттинга для диагностики этой стадии инфекции, т.к. при вторичном сифилисе положительный результат регистрируется

При скрытом раннем сифилисе чувствительность РМП и РСКк составила 92,0±5,5%, РСКт -96,0±4,0 %. Чувствительность РПГА, РИФабс и ИФА составила 96,0±4,0%. При обследовании больных скрытым ранним сифилисом методом иммуноблоттинга положительные результаты были получены у всех пациентов (100% чувствительность). При этом положительные результаты иммуноблоттинга регистрировались у двух больных скрытым ранним сифилисом с разноречивыми данными классических серологических методов (РСКк и РМП – отрицательные, РСКт – положительная в низком титре), когда требовалось проведение дифференциальной диагностики с ложноположительными результатами стандартных серологических реакций. Таким образом, проведенные исследования позволили сделать заключение о 100% чувствительности метода ИБ у больных скрытым ранним сифилисом, превышающей чувствительность стандартных нетрепонемных и трепонемных тестов.

При обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом, положительный результат в иммуноблоте был получен у 36 % пациентов (5 человек). Кроме ИБ, положительный результат был выявлен также в РМП (7% - 1 чел.) и ИФА (21% - 3 чел.), в то время как другие реакции (РСКТ, РСКК РИФабс и РПГА) оказались отрицательными. Таким образом, иммуноблоттинг оказался наиболее чувствительной реакцией, позволяющей устанавливать инфицированность у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом.

При тестировании сывороток крови лиц без указаний на наличие сифилитической инфекции (100) все 50 сывороток крови от больных кожными заболеваниями и 48 сывороток крови, взятых от доноров крови, показали отрицательные результаты. У двух доноров были зарегистрированы положительные результаты имуноблоттинга с невысокими уровнями позитивности реакции с отдельными рекомбинантными белками (на уровне 1-2+). Последующее обследование этих пациентов с помощью иммуноблоттинга и других специфических реакций (ИФА, РИФабс), проведенное через 2 недели после первого обследования, позволило установить ложный характер серопозитивности. Таким образом, специфичность линейного иммуноблоттинга при использовании диагностикума «INNO-LiaTM Syphilis Score» составила 98%.

Метод иммуноблоттинга позволяет не только проводить диагностику сифилиса по суммарному результату реакции, но и, при необходимости, давать оценку вклада каждого из рекомбинантных белков диагностикума и образования к ним антител в формирование общего результата реакции.

Примечание: по оси абсцисс - стадии сифилиса; по оси ординат – условные единицы измерения (по системе четырех «крестов»).

Рисунок 2. Средний уровень антителообразования к рекомбинантным белкам T.pallidum у больных сифилисом.

Проведенные исследования показали (рисунок 2), что антитела к отдельным рекомбинантным белкам Treponema pallidum (TpN17, TpN47, TpN15) регистрировались на самых ранних стадиях инфекции, начиная с периода инкубации (лица, контактные по сифилису, получающие превентивное лечение).

У этих пациентов максимальным было антителообразование по отношению к TpN17 (при количественном учете реакции по системе четырех «крестов» - на уровне 1,4 ± 0,01), однако образование антител по отношению к другим рекомбинантным антигенам бледной трепонемы (TpN47, TpN15, TmpA) было незначительным (к TpN47 - 0,9±0,01; к TpN15 – 0,8±0,005; к TmpA - 0,8±0,06), что не позволило регистрировать положительный результат реакции у всех пациентов. При первичном сифилисе отмечалось значительное (но не максимальное – в сравнении с вторичным сифилисом) усиление антителообразования по отношению ко всем используемым в ИБ антигенам (максимально - по отношению к TpN17: 2,9±0,01; к TpN47: 2,7±0,01; к TpN15: 2,2±0,15, минимально – к TmpA – 1,7±0,03), что сопровождалось возрастанием числа положительных результатов иммуноблоттинга до 100% за счет суммарного учета реакции на все рекомбинантные антигены.

В период «разгара» инфекции (вторичный, скрытый ранний сифилис) интенсивность антителообразования являлась максимальной и проявлялась в иммуноблоте по отношению ко всем четырем рекомбинантным антигенам Treponema pallidum (при вторичном сифилисе – к TpN17 - 3,8±0,003; к TpN47 - 3,7±0,005; к TpN15 - 3,8±0,003; к TmpA - 3,1±0,005 ; при скрытом раннем сифилисе: к TpN17 - 3,8±0,007; к TpN47 - 3,3±0,003; к TpN15 - 3,3±0,007; к TmpA - 3,3±0,007), что обеспечивало 100% чувствительность реакции.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»