WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Прямые методы исследования. Для получения сравнительных данных диагностической эффективности ПЦР и темнопольной микроскопии использовались: стандартный метод темнопольной микроскопии и метод ПЦР. При этом для выявления ДНК T. pallidum методом ПЦР использовался диагностикум «Амплисенс Treponema pallidum» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» (№ государственной регистрации ЛС-000916 от 18.11.2005г.). В качестве мишени для амплификации в данной тест-системе применен фрагмент гена поверхностного антигена бледной трепонемы - tpp47 (PCR tpp47), который отсутствует у других видов рода Treponema.

В случае несовпадения результатов ПЦР и ТПМ проводилось дополнительное тестирование образцов с помощью некоммерческой ПЦР-тест-системы, разработанной ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» с праймерами к 16S-рибосомальному гену микроорганизмов рода Treponema и последующей обратной транскрипцией, позволявшей на основе полученной РНК выявлять ДНК бледной трепонемы (PCR-16S-DNA). Входящие в состав тест-системы олигонуклеотидные праймеры позволяли амплифицировать фрагмент ДНК не только бледной трепонемы, но и ДНК других видов трепонем. В этой связи для видовой идентификации выявленных микроорганизмов определяли нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК, амплифицированных в ходе выполнения PCR-16S-DNA. Для этого был использован метод секвенирования, который осуществляли на секвенаторе Gene Analyzer ABI Prizm 3100, производства Applied Biosystem с использованием реагентов согласно прилагаемому протоколу. Полученные данные анализировались с помощью программного обеспечения BLAST и международной базы данных генетической информации GenBank, что позволяло установить вид микроорганизма.

В целях установления причин несовпадения результатов ПЦР и ТПМ проводилась также дифференциация сифилитической и герпетической этиологии эрозивно-язвенных высыпаний в области гениталий. Для этого образцы райц-серума одновременно исследовались на предмет выявления ДНК вируса простого герпеса I и II типа (ВПГ-1 и ВПГ-2). Данное исследование осуществляли с помощью ПЦР-диагностикума «Амплисенс HSV1/2» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора».

Серологические исследования. Использовались стандартные серологические методы диагностики, регламентированные Приказом № 87 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» от 26.03.2001 года: реакция микропреципитации (РМП), реакция связывания комплемента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией (РИФабс). Для постановки указанных реакций применялись зарегистрированные в Российской Федерации диагностикумы, выпускаемые на Российских и зарубежных предприятиях. Для постановки РИФабс, кроме того, использовался трепонемный антиген, полученный из 7-суточного орхита кролика (штамм Никольс).

Метод иммуноблоттинга (ИБ) Для проведения исследований была применена зарегистрированная в Российской Федерации коммерческая тест-система «ИННО-Лиа Сифилис усовершенствованный» («INNO - Lia™ Syphilis Score» производства фирмы «INNOGENETICS N.V.», Бельгия). Основу тест-системы составляют нейлоновые тест-полоски (стрипы), фиксированные на подложке из нейтрального пластика. На каждый стрип в виде дискретных линий нанесены антигенные детерминанты Treponema pallidum: три рекомбинантных белка (TpN47, TpN17 и TpN15) и один синтетический пептид (ТmрА). Кроме этого, на каждом стрипе имеются четыре контрольные линии: одна анти-стрептавидиновая – для оценки корректности (валидности) проведения теста (при правильно проведенном исследовании эта полоса не окрашивается) и три калибровочные линии, по интенсивности окрашивания соответствующие 3+, 1+, ± (cut off). Калибровочная линия, соответствующая 3+, содержит иммобилизованные антитела против IgG человека и одновременно служит контролем внесения образца биологического материала. Оценка результатов реакции проводится путем сравнения интенсивности окрашивания полос, полученного с образцом испытуемой сыворотки (плазмы) крови с окрашиванием трех калибровочных линий (рисунок 1.).

Рисунок 1. Расположение антигенов T.pallidum в иммуноблоттинге (диагностикум INNO-LIA Syphilis Score)

Диагностикум дает возможность учитывать суммарный результат реакции по совокупности данных по всем детерминантам, а также (при необходимости изучить интенсивность иммунного ответа) проводить полуколичественную оценку результатов реакции по каждой антигенной детерминанте в отдельности.

Методы статистики. Расчет средних значений показателей (М) с определением ошибки (m), среднего квадратического отклонения (), достоверности различий между показателями (t; p), частоты признаков (р) в выборке с вычислением ошибки (m) и достоверности различий между показателями проводился классическим методом с определением достоверности различий с помощью t-критерия Стьюдента и методом альтернативного варьирования. Статистический анализ проведен с помощью коммерческих па­кетов программ Excel (Microsoft Office 2000) на персональном компьютере Pentium IV.

Результаты исследования

1. Особенности современного клинического течения первичного и вторичного сифилиса. При изучении современных особенностей клинического течения ранних форм сифилиса у больных первичным сифилисом было отмечено некоторое преобладание эрозивных твердых шанкров (у 52,6% пациентов) над язвенными. Однако, по данным настоящего исследования, эрозивные шанкры встречались значительно реже, чем в конце ХIХ века (по данным А.Фурнье – в 8 случаев из 10 - 80%), что совпало с результатами современных авторов (В.Н.Бугорского, 2003; А.В. Вислобокова, 2006), отметивших по результатам собственных наблюдений и по литературным данным значительное увеличение частоты регистрации язвенных шанкров у больных первичным сифилисом в течение последних десятилетий ХХ века (с 25% в 1992г. до 66,7% к 2003г.),

У больных первичным сифилисом выявлен значительный процент множественных первичных сифилом (47,4%), что коррелировало с данными авторов второй половины ХХ – начала ХХI века (Антоньев А.А.,1978 – 39,1%; О.Г.Калугина, 2003 г. – 46,5%) и существенно отличалось от более низких показателей встречаемости множественных твердых шанкров, отмеченных дерматовенерологами конца ХIХ века (Ге А., 1895 - 13,6%; А.Фурнье 1899 - 17,47%;) и дерматовенерологами первой половины ХХ века (Мещерский Г.И.,1936 - 20%; Григорьев П.Г.,1938 - 30%). Отмечена также высокая частота регистрации осложненных форм первичного сифилиса (фимоз, парафимоз), - у 31,6% пациентов, соответствующая данным, полученным П.М. Зориным (1974), О.К Шапошниковым. (1980) и А.В Вислобоковым. (2006).

Регионарный лимфаденит был выявлен у всех обследованных (100%), что отличалось от показателей, полученных в исследовании О.Г.Калугиной, 2003 (отсутствие регионарного лимфаденита у 2.2% пациентов), П.М. Зорина, 1974 (2,8%), Ю.К. Скрипкина, 1975 (4,4%), А.А. Антоньева, 1978 (6,3%) и не позволяет считать отсутствие регионарного склераденита одним из признаков современного течения первичного сифилиса.

Вместе с тем, сопутствующий лимфангит не был отмечен ни у одного из обследованных пациентов (0%). Анализ данных литературы показал существенное снижение частоты регистрации данного признака: с 30% - 18,6% в конце ХIХ века (Bassereau, 1895; Фурнье А., 1899) до 1,7% в начале ХХI века (О.Г.Калугина, 2003), что позволило расценить его отсутствие у наблюдавшихся нами пациентов как одну из особенностей современного течения первичного сифилиса.

В результате проведенных исследований не отмечено каких-либо существенных отличий при сравнении клинических симптомов вторичного сифилиса с данными литературы прошлых лет. Вместе с тем, установлено существенное увеличение частоты встречаемости папулезных высыпаний на ладонях и подошвах (47,6%) в сравнении с данными авторов конца ХIХ века (Ге А., 1895 - 4,5-6%;), 70-х годов ХХ века: (Скрипкин Ю.К., 1975 – 22,1%; Антоньев А.А.,1978 - 20,7%), что коррелирует с данными, полученными О.Г.Калугиной (2003), А.В Вислобоковым. (2006). Отмечено увеличение частоты регистрации пустулезного сифилида (у 3,7% больных) в сравнении с данными авторов 60-70х годов ХХ века (Рахманов В.А., 1967- 2,4%; Абдулаев А.Х., 1972 - 0,57-2,1%; Антоньев А.А.,1978 - 1,3%). Выявлено значительное уменьшение частоты встречаемости сифилитической алопеции (у 13,4% больных) в сравнении с данными авторов конца ХIХ (Diday, 1895 – 90%) и отсутствие существенных изменений в частоте встречаемости лейкодермы (3,7% по результатам настоящего исследования; 4% - по данным Фурнье А.,1899; 2,1% - по данным Аковбяна В.А., 2002).

Таким образом, проведенные исследования позволили констатировать изменение клинического течения ранних манифестных форм сифилитической инфекции (первичного, вторичного сифилиса) в сравнении с данными дерматовенерологов конца ХIХ – первой половины ХХ века, что может быть расценено, как ее патоморфоз.

2.Диагностическая значимость полимеразной цепной реакции в сравнении с темнопольной микроскопией у больных с манифестными проявлениями при ранних формах сифилитической инфекции (первичный и вторичный сифилис). Для удобства сопоставления результатов исследования клинических образцов, полученных от больных сифилисом, на присутствие бледной трепонемы методами ТПМ и ПЦР все больные были разделены на четыре группы: А, B, C, D (таблица 1.)

Таблица 1.Результаты сравнительного изучения образцов клинического материала больных первичным и вторичным сифилисом методами ТПМ и PCR-tpp47

Группы

Результаты обнаружения T.pallidum прямыми методами

Больные первичным

сифилисом

Больные вторичным

сифилисом

Общее количество пациентов

A

Обнаружена методами ТПМ и PCR -tpp47

13

42

55

B

Обнаружена только методом PCR -tpp47

4

24

28

C

Обнаружена только методом ТПМ

2

3

5

D

Не обнаружена обоими методами

0

13

13

Общее количество обследованных методами ТПМ и PCR -tpp47

19

82

101

Как следует из представленной таблицы, у 55 пациентов (группа А, больные первичным и вторичным сифилисом) возбудитель сифилиса обнаруживался как с помощью ТПМ, так и методом PCR-tpp47. У 13 пациентов (группа D, больные только вторичным сифилисом) бледная трепонема не обнаруживалась ни методом ТПМ, ни методом PCR-tpp47. Таким образом, совпадающие результаты обоих методов прямого выявления бледной трепонемы (ТПМ и ПЦР) были получены у 68 (67%) обследованных пациентов. В обеих группах (А и D) результаты трепонемных и нетрепонемных серологических тестов были положительными.

У 28 пациентов (больные первичным и вторичным сифилисом, группа В) в райц-серуме сифилидов методом PCR-tpp47 обнаруживалась ДНК бледной трепонемы, а темнопольная микроскопия давала отрицательный результат. У 5 больных (группа С: 2 больных с диагнозом первичного и 3 – вторичного сифилиса) бледная трепонема выявлялась методом темнопольной микроскопии, а ПЦР давала отрицательный результат.

Таким образом, несовпадение результатов прямого выявления бледной трепонемы методами ТПМ и PCR-tpp47 было установлено у 33 пациентов (33%).

Для выяснения причин расхождения результатов между PCR-tpp47 и ТПМ и подтверждения обнаружения бледной трепонемы в исследуемом клиническом материале у 33 пациентов (группы В и С) было проведено дополнительное исследование образцов на наличие 16S-рибосомального гена трепонем. Кроме этого, с целью видовой идентификации микроорганизма был проведен анализ нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов 16S-рибосомального гена методом секвенирования. Такой анализ в последние годы стал основным в создании современной таксономической классификации микроорганизмов (Jill E.C., 2004). Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты проведения PCR-16SrDNA и секвенирования ДНК микроорганизмов в клинических образцах больных сифилисом с несовпадающими данными ТПМ и PCR-tpp47

Группа

Число образцов

PCR-tpp47

PCR-16SrDNA

Секвенирование

В

28

28

Обнаружена Treponema

Обнаружена T.pallidum

C

2

0

Обнаружена Treponema

Обнаружена T.putidum

C

3

0

Обнаружена Treponema

Обнаружена T.refringens

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»