WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

49

8,0

Ur-6

46

8,0

Br-2-1

Большая речка

50

8,2

Br-2-2

50

8,2

Se-1

Сея

49

8,2

Se-3

52

8,3

Se-4

ил

Липолитик

50

8,2

Se-5

Амилолитик

45

8,5

Se-6-1

45

8,4

Se-6-2

49

8,5

Ku-3

Кучигер

ил

Целлюлолитик

45

8,0

Клетки бактерий представлены спорообразующими палочками, размеры которых варьируют в пределах от 0,9-2,3 х 1,9-8,4 мкм. Размеры спор составляют 0,8-0,9 х 0,9-1,2 мкм. Все штаммы являются умеренными термофилами с диапазоном роста от 37 до 750С и оптимумом 45-600С. Диапазон pH для роста – от 6,0 до 9,5, оптимум pH – 8,0-8,5. Оптимальной концентрацией NaCl (г/л) для роста культур являлась 2-5 г/л, диапазон роста от 0 до 50 г/л.

Культуры использовали широкий спектр субстратов: арабинозу, галактозу, глюкозу, маннит, фруктозу, раффинозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, дульцит, инозит, пептон, дрожжевой экстракт, крахмал и глицерин. Рамноза, лактоза и сорбит не использовались. Все организмы были способны к брожению на глюкозе и сахарозе, но не сбраживали лактат, рамнозу, пептон, крахмал и целлюлозу. Тесты на каталазу и оксидазу положительные; не продуцировали аммиак, индол и сероводород. На безазотистой среде Эшби роста не проявляли. По физиолого-биохимическим свойствам все штаммы близки к видам Bacillus, Anoxybacillus.

Все выделенные штаммы были протестированы на наличие ферментативной активности. Все культуры проявили высокую протеазную активность (активно разжижали желатиновые диски) при 550С. Липазную активность определяли при температуре 550С. Всего 14 организмов показали способность расщеплять субстрат твин-40. При этом диаметр зон омыления варьировал от 6 до 15 мм. Высокую активность проявили бактерии по расщеплению крахмального агара, суммарно 19 из 22 штаммов показали различные зоны просветления (от 5 до 11 мм). Казеиназной активностью обладают только 9 изолятов, хотя на среде с пептоном отмечен рост у всех изолятов. Эндоцеллюлазной активностью обладают 3 изолята: Ur-6, Br-2-1 и Кu-3. Каталазная и оксидазная активности отмечены у всех штаммов. Таким образом, можно заключить, что выделенные штаммы аэробных органотрофных бактерий проявили потенциальную протеазную, липазную, амилазную, казеиназную, эндоцеллюлазную, каталазную и оксидазную активности. Все аэробно выделенные в культуру органотрофные бактерии способны к анаэробному росту за счет брожения, что позволяет им осуществлять разложение ОВ в условиях резких суточных колебаний О2.

Для анализа гена 16S рРНК было отобрано 5 штаммов (Ga-1-1, Ur-6, А2, Br-2-2 и Se-1). В результате было показано, что штамм Ga-1-1 имеет 100 % сходствa с Anoxybacillus sp. AF-04-1. Наибольшее сходство у культуры Ur-6 выявлено с Bacillus hemicellulosolyticum C-11 (99 %). Изоляты Br-2-2 и А2 на 97 и 99%, соответственно, близки к B. licheniformis BBDC6. У штамма Se-1 обнаружено 95 % сходства с A. pushchinoensis AT-2.

Культуры, выделенные из гидротерм с комбинацией наиболее экстремальных значений температуры и pH, привлекли внимание и были исследованы более детально.

Новая алкалотолерантная термофильная органотрофная бактерия «Аnoxybacillus mongoliensis». Из проб ила низкоминерализованных щелочных гидротерм Центральной Монголии Хужирт (Huzhirt), Шиверт (Shivert) и Цэнхэр (Tsenher) c температурами 37-840С и значениями pH 9,8-10,6 было выделено 10 штаммов аэробных термофильных бактерий. Пробы культивировали при 550С, без перемешивания. Чистые культуры были получены путем высева суспензии микроорганизмов на агар и последующих пересевов.

На поверхности агаризованной среды бактерии формировали округлые колонии диаметром 2-4 мм, кремовые, имеющие выпуклый профиль, ровные края и однородную структуру. Клетки имели форму прямых палочек, как правило одиночных или в парах (рис.2). В конце фазы замедленного роста наблюдали появление проспор, спорулирующих клеток и отдельно лежащих спор. Образующиеся эллипсоидальные споры располагались в материнской клетке терминально, несколько расширяя ее. Клетки имели размеры 1,2-1,5 x 4,5-10,6 мкм. Окраска по Граму положительная.

Рис.2. Морфология клеток штамма Т4.

Масштабная метка 5 мкм.

Все штаммы являются термофилами с диапазоном роста от 37 до 750С и оптимумом 58-610С. Диапазон pH от 6,0 до 10,5, оптимум pH 7,0-8,5. Оптимальной концентрацией NaCl (г/л) для роста культур являлась 2-5 г/л, диапазон роста от 0 до 50 г/л.

Бактерии способны в аэробных условиях утилизировать широкий спектр органических соединений: арабинозу, ксилозу, рибозу, глюкозу, маннит, фруктозу, рамнозу, раффинозу, сахарозу, инозит, глутамат, лактат, пируват, ацетат, пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, крахмал и углеводороды. Галактоза, дульцит, манноза, сорбит, лактоза, мальтоза, глицерин и гликолят культурами не использовались. Организмы способны к брожению на глюкозе и сахарозе, не сбраживали глутамат, лактат, пируват, рибозу, рамнозу, пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, крахмал и целлюлозу. Тесты на каталазу и оксидазу положительные; не продуцировали аммиак, индол.

Уровень ДНК-ДНК гомологии у всех 10-ти выделенных штаммов составил от 72 до 99% (табл.6). Таким образом, выделенные нами штаммы могут быть отнесены к одному виду.

Результаты анализа сиквенса гена 16S рРНК (1527 нуклеотидов) штаммов Т4, S3 и Н5 показали, что штаммы принадлежат к группе Clostridium/Bacillus грам-положительных бактерий, роду Anoxybacillus.

Таблица 6. ДНК-ДНК гомология между выделенными штаммами

Штамм

ГЦ

мол.

%

Гомология ДНК (%)

H1

H2

H5

H6

S1

S2

S4

T1

T4

T5

H1

43.8

100

H2

44.2

99

100

H5

44.2

95

98

100

H6

44.0

98

97

95

100

S1

44.2

98

100

S2

44,4

97

100

S4

44,6

98

98

100

Т1

44.4

100

Т4

44.2

72

100

Т5

44.2

98

99

96

100

Результаты анализа нуклеотидного состава ДНК показали, что содержание ГЦ пар в ДНК штамма Т4 составляло 44,2 мол%, что было близким к A. pushchinoensis (42,2 мол%) и A. flavоthermus (41,6 мол%) (табл. 7).

Таблица 7. ДНК-ДНК гомология между штаммами Anoxybacillus и штаммами T4 и Н5

Штамм

Содержание

Г+Ц

(мол %)

ДНК-ДНК сходство, %

K1T

DSM

2641T

T4

Н5

A. pushchinoensis K1T

42,2

100

A. flavоthermus DSM 2641T

41,6

58,8

100

Т4

44,2

28

38

100

Н5

44,2

31

47

72

100

Результаты ДНК-ДНК гибридизации выявили низкий процент гомологии ДНК для штамма Т4 и типовых штаммов A. flavоthermus (38 %) и A. pushchinoensis (28 %), что свидетельствует о таксономической обособленности Т4 от этих видов. Уровень гомологии ДНК между типовыми штаммами A. flavоthermus и A. pushchinoensis составляет 58,8%.

По совокупности фенотипических и генотипических признаков штамм Т4 является новым видом рода Anoxybacillus. В таблице 8 приведены отличительные признаки видов данного рода.

На основании проведенных исследований мы предлагаеми отнести выделенные штаммы к новому виду бактерий под названием «Anoxybacillus mongoliensis».

Таблица 8. Физиолого-биохимические свойства штамма «А. mongoliensis» Т4 и некоторых других представителей рода Anoxybacillus

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»