WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Хроматографическими методами выявлено, что БАВ в органах растения распределены неравномерно: простые фенольные соединения преимущественно содержатся в стеблях (кофейная, салициловая, анисовая, гентизиновая, галловая, хлорогеновая кислоты) и цветках (этилгаллат, феруловая, м-гидроксибензойная, фумаровая кислоты) растения, филимарин – в цветках; изокверцитрин, рутин и галловая кислота – в листьях растения.

Для выявления носителей фармакологической активности исследовали АОА выделенных индивидуальных соединений. Результаты эксперимента показали, что основной вклад в АОА лабазника вносят флавонолгликозиды и фенолокислоты. При этом наибольшей активностью обладают изокверцитрин и филимарин, которые по силе действия в 1,6 раза превосходят стандартный природный антиоксидант дигидрокверцетин (0,650 мкМ/лмин) (табл. 4). Учитывая тот факт, что антиоксидантное действие является одним из основных эффектов растительных ноотропов, можно предположить, что указанные гликозиды кверцетина вносят основной вклад в ноотропную активность лабазника вязолистного.

Таблица 4 – АОА индивидуальных соединений лабазника вязолистного

Название соединения

К, мкМ/лмин

Изокверцитрин и филимарин (ЛАВ-8, ЛАВ-9)

1.046

Эллаговая кислота (ЛАВ-16)

0.426

Галловая кислота (ЛАВ-7)

0.405

(ЛАВ-14)

0.356

Этилгаллат (ЛАВ-12)

0.306

Авикулярин (ЛАВ-13)

0.297

Рутин (ЛАВ-10)

0.263

(ЛАВ-15)

0.251

Салициловая кислота (ЛАВ-11)

0.106

Динамика накопления БАВ в лабазнике вязолистном

Содержание фенолокислот определяли прямым спектрофотометрическим методом при 271 нм с использованием РСО галловой кислоты. Наибольшее содержание фенолокислот выявлено в фазу цветения в цветках (8,9±0,3%) и листьях (4,6±0,1%). Содержание галловой кислоты в надземной части растения, собранной в различных районах колеблется от 3,1±0,3 до 5,5±0,4%.

Содержание флавоноидов определяли методом дифференциальной спектрофотометрии после реакции гидролизованного экстракта растения на 70% этаноле с р-ром AlCl3 при 425 нм с использованием ГСО кверцетина. Наибольшее содержание флавоноидов выявлено в фазу цветения в цветках (8,1±0,3%) и листьях (7,2±0,2%). В надземной части л.вязолистного, собранной в различных районах количество флавоноидов составляет от 2,8±0,2% до 5,6±0,3%.

Разработка параметров стандартизации сырья

лабазника вязолистного

В результате микроскопического исследования надземной части растения установили, что диагностическим признаком является наличие волосков различного типа: простых одноклеточных толстостенных на эпидермисе стебля, верхнем эпидермисе листа и по краю листа; кнутовидных на нижнем эпидемисе листа и железистых на верхнем эпидемисе листа и лепестка венчика.

Числовые показатели для цельного и измельченного сырья определяли в соответствии с методиками ГФ ХI. Влажность сырья составила 8,9±1,3%; зола общая 6,7±0,4%; зола не растворимая в 10% растворе хлористоводородной кислоты 0,8±0,2%; стеблей в т.ч. отделенных при анализе 26,1±3,4%; количество почерневших, побуревших, пожелтевших частей растения 9,5±1,7%; экстрактивные вещества, извлекаемые 70% водным этанолом 25,2±2,7%; содержание флавоноидов 2,8±0,2%; органическая примесь 0,9±0,1%; минеральная примесь 0,3±0,1%. Основная часть измельченного сырья проходит сквозь сита с диаметрами пор 1-4 мм (77,5 %). Сквозь сито с диаметром пор 7 мм не проходит 0,01±0,01%. Через сито 0,25 отсеивается 2,7±0,6% сырья.

Подлинность и содержание действующих веществ определяли по флавоноидам. При этом предварительно были подобраны оптимальная система растворителей для ТСХ и количество экстракта для нанесения на пластинку, отработаны условия проведения экстракции, гидролиза и реакции с AlCl3.

Установлено, что оптимальными условиями экстрагирования являются: трехкратная экстракция 70% водным этанолом в соотношении 1:25, измельченность сырья от 0,5 до 3 мм (рис. 4).

Гидролиз гликозидов кверцетина проходит полностью при добавлении 5% конц. хлористоводородной кислоты и нагревании на кипящей водяной бане в течение 120 мин. Для полного проведения реакции необходимо вносить 3 мл 5% этанольного раствора AlCl3 (рис. 5).

Методика качественного ТСХ-анализа надземной части л.вязолистного. Около 1,0г сырья (т.н.) измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, экстрагируют 70% водным этанолом трижды по 30 мин на водяной бане при 80 °С. Извлечения объединяют и фильтруют через бумажный фильтр («красная лента») в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 70% этанолом до метки (раствор А, в последующем используют для колич. анализа). На линию старта пластинки «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ» (Россия) микропипеткой наносят 0,04 мл полученного извлечения. Хроматографическую пластинку помещают в камеру, которую предварительно насыщают смесью растворителей хлороформ-этанол (6:3), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 8 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе и просматривают в УФ-свете. Должны обнаруживаться два пятна темно-желтого цвета с величиной Rf около 0,61 и 0,40 (изокверцитрин и филимарин), которые после обработки 5% этанольным раствором AlCl3 проявляются в виде хорошо заметных пятен желтого цвета; допускается наличие пятен других флавоноидов.

Методика количественного определения действующих веществ в надземной части л.вязолистного. 20 мл раствора А, приготовленного как указано ранее, помещают в колбу со шлифом вместимостью 100мл, добавляют 5% конц. HCl и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 120 мин. 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 3 мл 5% этанольного раствора AlCl3 и доводят 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре через 45 мин при 425 нм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца кверцетина. Для этого 1 мл 0,02% раствора кверцетин-стандарта помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 3 мл 5% раствора AlCl3 и доводят до метки 95% этанолом.

Приготовление р-ра ГСО кверцетина: 0,0100 г (т.н.) ГСО кверцетина, высушенного до постоянной массы при 100-105 °С, растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл в небольшом количестве 95% этанола, добавляют 1 каплю конц. HCl и доводят объем раствора тем же спиртом до метки. Содержание флавоноидов рассчитывают по формуле:

Х(%) = D · Mо · 100 · 25 · 1 · 100 · 100 = D · Mо · 20000,

Dо · М · 1 · 50 · 25 · (100-W) Dо · М · (100-W)

где D- оптическая плотность испытуемого раствора;

Dо- оптическая плотность ГСО кверцетина (среднее из трех измерений);

Mо- масса ГСО кверцетина, г;

М- масса навески сырья, г;

W- влажность, %.

Создание лекарственной формы лабазника вязолистного

На первом этапе технологии лекарственной формы растения предложен жидкий экстракт лабазника, полученный методом реперколяции с делением сырья на равные части, с использованием 5 перколяторов по 3 законченных цикла, экстрагент 70% этанол. Проводили 4 опыта, варьируя время экстракции (10, 14, 18 и 24 ч). В каждом из полученных экстрактов определяли выход экстрактивных веществ в соответствии с методикой ГФ ХI изд., вып.2. Выявили, что оптимальное время контакта фаз составляет 14 часов (рис.6).

ЖЭ лабазника представляет собой темно-коричневую жидкость со специфическим приятным запахом. Его стандартизация проведена по методикам ГФ XI изд. по сквозной схеме. Определены сухой остаток, содержание этанола и количественное содержание действующих веществ (табл. 5). Качественный анализ ЖЭ лабазника проводили методом ТСХ по описанной выше методике. Оптимальное количество ЖЭ для нанесения на пластинку составляет 0,002 мл.

Методика количественного определения действующих веществ в ЖЭ лабазника. 1,0 мл ЖЭ помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят 95% этанолом до метки (раствор А). 20 мл раствора А помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 5% конц. HCl и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч. 1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 3 мл 5% этанольного раствора AlCl3, доводят 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре через 45 мин при 425 нм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца кверцетина. Содержание флавоноидов рассчитывают по формуле:

Х(%) = D · Mо · 25 · 25 · 1 · 100 = D · Mо · 50,

Dо · А · 1 · 50 · 25 Dо · А

где D- оптическая плотность испытуемого раствора;

Dо- оптическая плотность ГСО кверцетина (среднее из трех измерений);

Mо- масса ГСО кверцетина, г;

А- аликвота ЖЭ, мл.

Таблица 5 – Параметры качества жидкого экстракта

лабазника вязолистного

Серия ЖЭ

ЖЭ (январь,2005 г)

ЖЭ (октябрь,2005 г)

Сухой остаток, %

7,2±0,3

7,7±0,1

Содержание этанола, %

69,2±0,5

66,2±0,5

Содержание флавоноидов (Х,%), метрологические характеристики

=1,30±0,01; 2=0,0001; =0,0070; Х=0,0040; Ip=0,0127; А=0,97%

=1,31±0,01; 2=0,0001; =0,0070; Х=0,0040; Ip=0,0127; А=0,96%

ВЫВОДЫ

  1. Впервые осуществлено углубленное химико-фармакогностическое исследование надземной части лабазника вязолистного. Установлено, что растение содержит сложный комплекс фенольных соединений, состоящий из простых фенолов, фенолкарбоновых кислот, кумаринов, флавоноидов и танинов.
  2. На основании фармакологических исследований из активных фракций колоночной хроматографией на силикагеле и полиамиде выделено 14 индивидуальных соединений. С помощью химических, хроматографических и спектральных методов установлена структура 12 веществ (олеаноловая, урсоловая, анисовая, салициловая, эллаговая кислоты, галловая кислота и ее этиловый эфир, кверцетин, авикулярин, рутин, изокверцитрин, филимарин). Методом ГЖХ-МС спектрометрии идентифицировано 10 соединений.
  3. Впервые выделен ранее не описанный в литературе флавонольный гликозид, названный филимарин (3,5,7,3/-тетрагидроксифлавон-4/-О--D-галактопиранозида).
  4. Выявлен факт корреляции антиоксидантных свойств лабазника вязолистного с его ноотропной активностью. Установлено, что наибольшей антиоксидантной активностью обладают гликозиды кверцетина (изокверцитрин и филимарин).
  5. Изучена динамика содержания флавоноидов и фенолокислот в надземной части лабазника вязолистного. Наибольшее их содержание выявлено в фазу цветения в цветках и листьях растения.
  6. Разработанные методики стандартизации сырья и на их основе проект ФС «Трава лабазника вязолистного», а также технология жидкого экстракта лабазника дают возможность его внедрения в качестве источника ноотропного фитопрепарата.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Химическое исследование активного экстракта лабазника вязолистного // Тез. докл. 63-й итог. науч. студенч. конф. им. Н.И. Пирогова. – Томск, 2004.– С. 235-236 (соавт. О.П. Слепушкина, М.Г. Нагаев).
  2. Химическое исследование надземной части лабазника вязолистного // Лекарственные растения в фармакологии и фармации: тез. докл. науч. конф., посвящ. 50 – летию Алтайского гос. мед. университета. – Барнаул, 2004. – С. 306-307 (соавт. Е.А. Краснов, И.В. Шилова, О.П. Слепушкина).
  3. Гепатопротекторное средство, обладающее антиоксидантной активностью и способ его получения. (Е.А. Краснов, И.В. Шилова, Т.Г. Хоружая, Т.П. Новожеева, Т.В. Жаворонок, Н.И. Суслов, Е.Ю. Авдеева) / патент № 2310467 РФ от 17.08.2005 г.
  4. Фенольные соединения FILIPENDULA ULMARIA L.(MAXIM.) // Химия природ. соедин. – 2006. – № 2. – С. 122-124 (соавт. Е.А. Краснов, В.А. Ралдугин, И.В. Шилова).
  5. Химический состав и антиоксидантные свойства растений рода лабазник и альфредия // Химия и технология растительных веществ: тез. докл. IV Всеросс. науч. конф. – Сыктывкар, 2006. – С. 217 (соавт. И.В. Шилова, Е.А. Краснов, Н.В. Кувачева, О.П. Слепушкина, Е.И. Короткова, А.Н. Лукина).
  6. Лабазник вязолистный – перспективное лекарственное растение флоры Сибири // Науки о человеке: матер. VIII конгр. молодых ученых и специал. – Томск, 2007. – С. 214-215 (соавт. И.В. Шилова).
  7. Содержание биологически активных веществ в лабазнике вязолистном // «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений»: матер. II Междунар. науч. конф. – Алматы, 2007. С. 200 (соавт. И.В.Шилова, Е.А.Краснов).
  8. Изучение химического состава фракций лабазника вязолистного, обладающих антиоксидантной и гепатозащитной активностью // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: тез. докл. Всеросс. науч. конф. Барнаул, 2007. – С. 334-336 (соавт. И.В. Шилова, Е.А. Краснов, В.А. Ралдугин).
  9. Тритерпеновые и фенольные соединения лабазника вязолистного // «Химия и медицина»: матер. VI Всеросс. науч. семинара с Молодежной науч. школой. – Уфа, 2007 – С.122-123 (соавт. И.В. Шилова, Е.А. Краснов, В.А. Ралдугин).
    Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»