WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Для оценки АРА экстрактов использовали реакцию со свободным стабильным радикалом ДФПГ. В качестве характеристики АРА использовали процент интенсивности взаимодействия ДФПГ с соединениями, содержащимися в экстракте и время, за которое ДФПГ прореагирует на 50% (1/2). По АРА экстракты растения на 70 и 95 % этаноле (1/2 составило 5 и 3 минуты соответственно) приближаются к дигидрокверцетину (1/2 равно 2 мин) (рис. 1).

АОА фракций экстракта лабазника на 70% водном этаноле изучали методом катодной вольтамперометрии, основанном на реакции электровосстановления кислорода. В качестве фонового электролита использовали фосфатный буфер pH 6,86. Концентрация образца в ячейке составила 1·10-4 г/мл. АОА фракций оценивали по кинетическому критерию АОА (К (мкМ/л·мин)), который отражает количество прореагировавших с образцом кислородных форм. Полученные результаты показали, что ЭАФ приближается по силе АОА к природному антиоксиданту дигидрокверцетину, а ХЛФ к аскорбиновой кислоте (рис. 2).

Таким образом, в результате экспериментов выявили факт корреляции антиоксидантных свойств л.вязолистного с его ноотропной активностью.

Исследование БАВ лабазника вязолистного

Для проведения химических исследований из надземной части растения получали экстракт на 70% водном этаноле (выход 31,9%), который затем фракционировали рядом растворителей с возрастающей полярностью (хлороформом, этилацетатом, бутанолом-1). Химический состав полученных фракций исследовали качественными реакциями и хроматографией в тонком слое и на бумаге с достоверными образцами. В результате в активном экстракте обнаружили: простые фенольные соединения в ХЛФ и ЭАФ; флавоноиды и органические кислоты в ХЛФ, ЭАФ, БФ; кумарины в ЭАФ и БФ; дубильные вещества во всех фракциях, кроме хлороформной; сапонины в ЭАФ; аминокислоты в БФ и водном остатке.

Учитывая результаты фармакологического исследования, для выявления носителей активности углубленному химическому изучению подвергли хлороформную и этилацетатную фракции экстракта лабазника на 70% этаноле.

ХЛФ разделяли методом флэш-хроматографии, с последующей рехроматографией на колонках с силикагелем по схеме 1.

Схема 1 – Разделение хлороформной фракции лабазника вязолистного

После перекристаллизации фракции 3/1 из бензола получили кристаллы кремового цвета с фруктовым запахом (ЛАВ-1; выход 20 мг), возгоняющиеся при 177-178 оС. max 252 нм (MeOH). ИК-спектр (КВr),, см-1: 3443, 2916, 2965, 2848, 1603, 1463. По данным масс-спектра соединение имеет формулу С8Н8О3, М+152. В ПМР-спектре (DMSO-d6) вещества, записанном на спектрометре Bruker DRX-500 (рабочая частота 500, 13 МГц), наблюдались сигналы,, м.д.: 3,86 (с, 3Н), 6,94 (с, Н-3, Н-5), 8,05 (с Н-2, Н-6). На основании спектральных данных полученное вещество идентифицировано с анисовой кислотой (4-метоксибензойная кислота).

Фракция 2/2 (ЛАВ-3) представляет собой жидкость желтого цвета с медовым запахом (выход 115 мг), легко растворимую в хлороформе. Компонентный состав ее изучали методом ГЖХ-масс спектрометрии на приборе Trace DSQ (Thermoelectron corp., США), программное обеспечение Xcalibur 1.4. Условия анализа: колонка BPX5, 25м; Тисп = 2800С; Vг/н = 1 мл/мин; растворитель – хлороформ; Ттермостата от 40 до 3000С; скорость нагрева 10 0/мин; задержка хроматограммы 5 мин; сканирование 33 – 650 а.е.м. Компонентный состав фракции представлен преимущественно алифатическими кетонами, а так же ароматическими карбоновыми кислотами и их производными: гексаналь (0,23%, tr 8,12 мин), бензойная кислота (0,56%, tr 14,78 мин), салициловая кислота (2,5%, tr 16,83 мин), 4-метоксибензойная кислота (0,63%, tr 18,78 мин), 4,4,7а-триметил-5,6,7,7а-тетрагидро-2(4Н)-бензофуранон (1,3%, tr 20,69 мин), диэтилфталат (16,32%, 20,86 tr мин), 6,10,14-триметил-2-пентадеканон (1,55%, 23,39 tr мин), бис-(2-метилпропил)-фталевая кислота (0,52%, tr 23,85 мин), 2-гептадеканон (0,97%, tr 24,06 мин), метиловый эфир 14-метил-пентадекановой кислоты (0,97%, tr 24,23 мин), бутилоктиловый эфир фталевой кислоты (7,67%, tr 24,88 мин), 2-нонадеканон (1,43%, tr 26,05 мин), (4-метоксифенил)метиловый эфир бензолуксусной кислоты (1,17%, tr 26,36 мин), диизооктиловый эфир фталевой кислоты (64,22%, tr 30,32 мин) (рис.3).

Из фракции 3/2 после перекристаллизации из метанола получили белый мелкокристаллический порошок (ЛАВ-4; выход 43 мг) с т.пл. 306 – 308 оС. Вещество хроматографически однородно и не обнаружило депрессии т.пл. в пробе смешения с достоверным образцом олеаноловой кислоты.

Аналогичная обработка фракции 4/2 привела к получению мелкокристаллического порошка (ЛАВ-5; выход 8 мг) с т.пл. 285 – 287 оС. На основании физико-химических свойств и сравнения с достоверным образцом вещество идентифицировано как урсоловая кислота.

ЭАФ подвергали предварительному разделению с помощью флэш-хроматографии на полиамиде. Из полученных подфракций в результате рехроматографии на колонках с силикагелем выделен ряд индивидуальных фенольных соединений (схема 2).

После перекристаллизации фракции 3/4 из смеси метанола с хлороформом (2:3) получили мелкокристаллический порошок лимонно-желтого цвета (ЛАВ-6; выход 56 мг) с т.пл. 312-313 оС. max 256, 371 нм (MeOH). Идентифицирован по отсутствию депресcии т.пл. пробы смешения вещества с заведомым образцом как кверцетин. Значение Rf ЛАВ-6 совпадает с аналогичным значением заведомо известного стандартного образца кверцетина.

Схема 2 – Разделение этилацетатной фракции лабазника вязолистного

В результате перекристаллизации фракции 4/4 из смеси метанол-хлороформ (1:20) получили сфероидные кристаллы (ЛАВ-7; выход 120 мг), возгоняющиеся при 240 оС. max 233, 251 нм (MeOH). ИК-спектр (КВr),, см-1: 3500, 3277, 2915, 2857, 1615, 1650, 1670, 1543, 1428, 1386, 1320, 1100, 1023. Масс-спектр вещества совпадает с таковым галловой кислоты.

Фракция 6/4 является доминирующей по массе. Перекристаллизацией ее из смеси метанола с хлороформом (1:20) получили мелкокристаллический светло-желтый порошок (выход 2,0 г), с т.пл. 219-220 оС. На БХ в 30% уксусной кислоте обнаруживаются два пятна с Rf 0,27 и 0,56. При просматривании хроматограмм в УФ-свете нижнее пятно флюоресцирует желтым цветом, а верхнее – темное. После обработки 5% р-ром алюминия хлорида оба пятна окрашиваются в лимонно-желтый цвет. При проведении цианидиновой реакции по Брианту наблюдали красное окрашивание водного слоя, что указывает на гликозидный характер вещества. В результате проведения кислотного гидролиза установили, что агликоном является кверцетин, а углеводными компонентами – D-глюкоза и D-галактоза. Разделение двух близких флавонольных гликозидов оказалось сложной экспериментальной задачей и было осуществлено путем рехроматографии на полиамиде, активированном 1% раствором хлороводородной кислоты для селективности разделения.

В результате выделили желтый кристаллический порошок (ЛАВ-8, из 50% этанола т.пл. 224–225 oС). На основании физико-химических свойств и сравнении с заведомым образцом идентифицирован с изокверцитрином.

При дальнейшем элюировании колонки получили желтые кристаллы (ЛАВ-9). Кислотный гидролиз показал, что вещество является монозидом, агликон которого идентифицирован с кверцетином, а сахарный остаток – с D-галактозой. ЛАВ-9 не является гиперозидом, cтандартный образец которого имеет Rf 0,67 в тех же условиях.

Для определения структуры ЛАВ-9 в кристаллической паре гликозидов кверцетина (ЛАВ-8 и ЛАВ-9) мы обратились к данным спектров ЯМР (табл. 1,2,3). В спектрах, записанных в Py-D6 и в DMSO-D6, видно, что компоненты смеси – два моно-O-гликозида кверцетина, находящиеся в соотношении 7:5. Согласно большой величине дублетного расщепления сигнала аномерного протона в ПМР-спектре (8 Гц) они являются -гликозидами (при -конфигурации аномерного центра, как известно, величина J равна нулю или незначительна). Один из них, как установлено методом БХ, является 3-O--D- глюкопиранозидом кверцетина и ему отвечает компонент смеси, находящийся в меньшем количестве. Второй гликозид является, таким образом, O--D- галактопранозидом кверцетина, а местом присоединения галактозы является атом кислорода при С-4'. Это подтверждается неизменностью положения сигналов для атомов С-5 и C-7 в спектре ЯМР 13С по сравнению со спектром ЯМР 13С кверцетина, наблюдением выраженного орто-эффекта на сигнале атома Н-5' (и неизменностью положения сигнала H-2' по сравнению с тем же спектром) в спектре ПМР и, наконец, наблюдением того же влияния на кольцевые углеродные атомы флавонового ядра как при введении в положение С-4' молекулы изомерного сахарного остатка - глюкозы.

Таблица 1 – Данные спектра ЯМР 13С кристаллической смеси 4'-О-галактопиранозида кверцетина (2) и 3-O-глюкопиранозида кверцетина (3, изокверцитрина)

(DMSO-D6, 0 ТМС, , м. д.)

______________________________________________­­­­­­­­­­­­­­­­­_ № атома С 1* 2 3 _______________________________________________

2 146.9 146.82 c 156.34 c

3 135.5 136.45 c 133.13 c

4 175.8 176.10 c 177.53 c

5 160.7 160.76 c 161.27 c

6 98.2 98.31 д 98.71 д

7 163.9 164.10 c 164.16 с

8 93.3 93.57 д 93.57 д

9 156.2 156.28 c 156.28 c

10 103.1 103.15 c 103.96 c

2' 115.3a 115.97 д 115.23 д

1' 122.1 125.13 c 122.05 c

3' 145.0 145.95 c 144.88 c

4' 147.6 146.37 с 148.52 c

5' 115.6a 115.18 д 115.81 д

6' 120.0 119.58 д 121.12 д

*Данные приведены для сравнния (кверцетин).

Таблица 2 – Данные углеводной части спектра ЯМР 13С гликозидов 2 и 3

(DMSO-D6, 0 ТМС, , м. д.)

_____________________________________________________

Галактоза 2 3 Глюкоза

_____________________________________________________

102.3 101.78 101.35 101.4

75.8 75.88 77.32 77.5

73.4 73.20 75.98 78.6

71.3 71.23 73.71 74.3

68.0 67.96 69.81 70.3

60.8 60.73 60.17 61.3

_______________________________________________________

Таблица 3 – Химические сдвиги и константы спин-спинового взаимодействия (J/ Гц) в спектрах ПМР кверцетина 1 и кристаллической смеси соединений 2 и 3

(DMSO-D6, 0 ТМС)

____________________________________________________________

Н 1 2 3

_

H-6 6.18 (д, 2.0) 6.20 (д, 2.0) 6.21 (д, 2.0)

Н-8 6.40 (д, 2.0) 6.45 (д, 2.0) 6.42 (д, 2.0)

Н-2' 7.67 (д, 2.0) 7.70 (д, 2.0) 7.57 (д, 2.0)

Н-5' 6.88 (д, 9.0) 7.26 (д, 9.0) 6.84 (д, 9.0)

Н-6' 7.54 (дд, 9.0; 2.0) 7.62 (дд, 9.0; 2.0) 7.65 (дд, 9.0; 2.0)

Информация о нахождении в растениях 4'-О--D-галактопиранозида кверцетина, названного нами филимарином, в литературе не найдена. Соединение представляет собой желтый мелкокристаллический порошок с т.пл. 217-218 oС (из этанола); []D – 56,60 o (С 0,53; этанол); max 254, 364 нм. ИК-спектр,, см-1 (KBr): 3382 (OH), 2928, 2900 (CH2), 1659 (CO), 1513, 1558, 1610 (бенз. кольцо), 1009, 1040, 1088 (пираноид. кольцо углевода), 997 (-гликозид. связь). Спектр ЯМР 1Н,, м.д. (J,Гц): 6.20 (Н-6, д, 2.0), 6.45 (Н-8, д, 2.0), 7.26 (Н-5’, д, 9.0), 7.62 (Н-6’, дд, 9.0, 2.0), 7.70 (Н-2’, д, 2.0). Спектр ЯМР 13С,, м.д.: 146.82 c (C-2), 136.45 c (C-3), 170.10 c (C-4), 160.76 c (C-5), 98.31 д (С-6), 164.10 с (С-7), 93.57 д (С-8), 156.28 с (С-9), 103.15 с (С-10), 125.13 с (С-1’), 115.97 д (С-2’), 145.95 с (С-3’), 146.37 с (C-4’), 115.18 д (С-5’), 119.58 д (С-6’); углеводная часть: 101.78, 75.88, 73.20, 71.23, 67.96, 60.73.

После перекристаллизации фракции 7/4 из смеси ацетона с хлороформом (3:4) получили светло-желтого цвета кристаллический порошок (ЛАВ-10; выход 35 мг) c т.пл. 208 – 210 oС. max 257, 360 нм. Значение Rf ЛАВ-10 совпадает с аналогичным значением заведомо известного стандартного образца рутина.

Фракцию 2/5 подвергали перекристаллизации из бензола. В результате получили бесцветные игольчатые кристаллы (ЛАВ-11; выход 35 мг) с т.пл. 178 – 180 oС. max 275 нм; m/z 138 (М+) 120, 92, 64, 60, 53, 45, 39, 31. По физико-химическим свойствам вещество идентично салициловой кислоте.

Из фракции 4/5 перекристаллизацией из смеси метанол-хлороформ (2:3) выделили белый кристаллический порошок (ЛАВ-12; выход 25 мг) c т.пл. 159 – 160 oС. max 231, 305 нм; m/z 198 (М+) 183, 170, 153, 125, 79, 51, 39, 28. На основании спектральных данных полученное вещество идентифицировано с этиловым эфиром галловой кислоты.

После нагревания фракции 2/6 со смесью метанол-хлороформ-гексан (1:1:1,5) по охлаждении выделен ярко-желтый мелкокристаллический порошок (ЛАВ-13; выход 31 мг) с т.пл. 229-230 оС. Кислотный гидролиз вещества привел к получению агликона, отождествленного с кверцетином и сахарного остатка, идентичного L-арабинозе. max 257, 365 нм. Идентифицирован по отсутствию депресcии т.пл. пробы смешения с заведомым образцом вещества как кверцетин-3-О-L-арабопиранозид (авикулярин).

Из фракции 3/6, в результате перекристаллизации из смеси ацетон-хлороформ (2:3) получили светло-розовый мелкокристаллический порошок (ЛАВ-14; выход 18 мг) c т.пл. 177 – 179 оС. max 232, 281 нм. ИК-спектр (КВr),, см-1: 3390, 1446, 1339 (ОН); 2924, 1200, 1127, 1055, 820, 788, 764 (СН2, СН3); 1742 (СООН); 1609, 1524 (бенз. кольцо); 1288 (СО).

При перекристаллизации фракции 3/3 из этанола выделили светло-желтые кристаллы (ЛАВ-15; выход 30 мг) c т.пл. 350 – 352 оС. max 254, 361 нм. ИК-спектр (КВr),, см-1: 3556 (ОН); 3075, 1195, 1055, 882 (СН2,СН3); 1698 (СООН); 1616 (бенз. кольцо); 1340 (СО). Структура двух фенольных соединений (ЛАВ-14 и ЛАВ-15) до настоящего времени еще не установлена.

Из фракции 8/4 выделили белый мелкокристаллический порошок (ЛАВ-16; из ацетона выход 30 мг) c т.пл. 266-267 оС. max 222, 276. ИК-спектр (КВr),,

см-1: 3396, 1614, 1716, 1352, 1321. По данным масс-спектра соединение имеет формулу С14Н6О8 с m/z 302 (М+) и отождествлено с эллаговой кислотой.

Таким образом, из активных фракций л.вязолистного выделены 14 индивидуальных соединений, структура 12 из которых установлена: олеаноловая, урсоловая, анисовая, салициловая, эллаговая кислоты, галловая кислота и ее этиловый эфир, кверцетин, изокверцитрин, авикулярин, рутин и ранее не описанный в литературе филимарин.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»