WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Из литературных данных известно, что увеличение скорости процесса биодеструкции органических соединений возможно с помощью биокатализаторов на основе иммобилизованных живых клеток микроорганизмов в «мягких» условиях, при которых сохраняется жизнеспособность и функциональная способность клеток. Нами в качестве носителя использован криогель поливинилового спирта, что обеспечивает иммобилизацию бактериальных клеток при физиологических значениях рН, оптимальной температуре и без применения химических веществ. Каталитическую активность клеток родококков определяли в экспериментах по динамике биотрансформации парацетамола в субстанции и таблетках, отбирая пробы каждые 2 часа в течение эксперимента.

Использование клеток R. erythropolis ИЭГМ 767, предварительно выращенных на феноле и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта, позволяет значительно ускорить (до 12 часов) процесс биодеструкции парацетамола, внесенного в виде субстанции (рис. 9 и 10). В то же время, продолжительность процесса с участием иммобилизованных клеток R. ruber ИЭГМ 77, также адаптированных к фенолу, составляет более 24 ч. Изменение содержания парацетамола, внесенного в виде таблеток, с использованием адаптированных или чистых клеток R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77 в этих же условиях значительно меньше. Возможно, влияние вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток, ингибирует процесс биотрансформации парацетамола иммобилизованными клетками.


1 - субстанция, иммобилизованные адаптированные клетки;

2 - субстанция, иммобилизованные чистые клетки;

3 - таблетки, иммобилизованные адаптированные клетки;

4 - таблетки, иммобилизованные чистые клетки

Рис. 9. Изменение содержания парацетамола в культуральной среде при использовании иммобилизованных адаптированных и чистых клеток R. erythropolis ИЭГМ 767

Рис. 10. Изменение содержания парацетамола в культуральной среде при использовании иммобилизованных адаптированных и чистых клеток R.ruber ИЭГМ 77

Для реализации установленных в ходе эксперимента условий утилизации парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus в укрупненном масштабе разработана документация, регламентирующая процесс. Подготовлены технологические схемы процесса биодеструкции ЛС адаптированными иммобилизованными и адаптированными свободными клетками актинобактерий рода Rhodococcus и лабораторный регламент утилизации парацетамола применительно к ферментационной установке «Фермус – 3» с загрузкой, в 30 раз превышающей загрузку при выполнении лабораторного эксперимента. На основе разработанной документации проведена утилизация субстанции парацетамола со сроком хранения более 5 лет и таблеток со сроком хранения более 3-х лет. Полученные результаты (табл. 3) свидетельствуют о возможности масштабирования объема ферментера и последующей промышленной реализации проекта.

Таблица 3.

Результаты количественного определения парацетамола (субстанция и таблетки) в культуральных средах в процессе биодеструкции на установке «Фермус 3» при использовании адаптированных R. erythropolis ИЭГМ 767

Время инкубации, сутки

Содержание парацетамола, %

Таблетки

Субстанция

0

1

2

3

4

5

6

93,50

50,42±2,87

27,65±2,31

11,90±2,14

1,18±3,04

0,00

0,00

98,67

83,15±3,05

65,19±3,17

57,97±3,12

24,45±2,45

11,60±2,21

2,30±2,17

Примечание. Каждый результат – среднее из 3-х значений

Параллельно в культуральной среде проводили количественное определение п-АФ, остаточное содержание которого в субстанции составляет 3,15% на 15 сутки. Скорость образования и содержание метаболита в культуральной среде в процессе биодеструкции парацетамола в таблетках значительно выше и его содержание на 11 сутки составляет 1,03%.

Свойства продуктов трансформации парацетамола. В течение эксперимента появляется, накапливается и укрупняется черный с серо-фиолетовым оттенком аморфный осадок. Температура плавления полученного осадка (шлама) находится в интервале 150-2050С (с разложением). Он практически нерастворим в воде, эфире и хлороформе, мало растворим в гексане и ацетонитриле, хорошо растворим в этилацетате, ацетоне, метиловом и этиловом спиртах, легко растворим в растворе аммиака и очень легко - в диметилсульфоксиде и 1 М растворе натрия гидроксида. Растворы полученного осадка в спиртах окрашены в красно-коричневый цвет, в ацетоне, эфире и этилацетате имеют желто-оранжевую окраску, а в растворе аммиака - сине-фиолетовую.

Конечный продукт трансформации парацетамола представлен сложной смесью веществ, ряд компонентов которых на данном этапе исследования не представляется возможным идентифицировать. Их значения Rf не совпадают со значениями Rf веществ, полученных при исследовании биотрансформации парацетамола в этих системах.

Установлено, что осадок (шлам) не является токсичным для окружающей среды. Значение LD50 составляет 3.000 (2.400 – 3.800) мг/кг при внутрибрюшинном введении мышам. Для сравнения LD50 парацетамола в этих же условиях составляет 2.728 мг/кг. При пероральном введении значение LD50 более 4.000 мг/кг.

Исследование на фитотоксичность при использовании в качестве тест-объектов семян и проростков травяных культур в результате обработки почвы осадком (шламом) показало, что биомасса исследуемых фитокультур и растений, выращенных на чистой сельскохозяйственной почве, значительно различается (табл. 4 и 5).

Таблица 4.

Влияние конечных продуктов биодеструкции парацетамола на вегетативное развитие овса

Показатель фитотоксичности

Контроль

Содержание конечных продуктов в почве*

0,25 г

0,5 г

Длина стебля, мм

Длина корня, мм

Биомасса сухая, г

64,1±1,58

49,4±1,44

0,6838±0,27

116,7±5,45

62,4±4,74

0,6883±0,32

125,4±8,13

58,1±6,23

0,7205±0,38

Примечание. Каждое значение – среднее определение при трехкратном повторении

* Содержание исследуемых продуктов в 100 г почвы

Таблица 5.

Влияние конечных продуктов биодеструкции парацетамола на вегетативное развитие гороха

Показатель фитотоксичности

Контроль

Содержание конечных продуктов в почве*

0,25 г

0,5 г

Длина стебля,мм

Длина корня, мм

Биомасса сухая,г

77,3±3,11

52,4±2,48

0,4865±0,26

95, 5±4,23

67,2±3,96

0,7759±0,15

110,9±5,73

76,4±4,15

0,9112±0,21

Примечание. Каждое значение – среднее определение при трехкратном повторении

* Содержание исследуемых продуктов в 100 г почвы

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что полученный после окончания процесса биодеструкции парацетамола шлам нетоксичен для животных и оказывает благоприятное воздействие на растения. Возможно, что исследуемый продукт является дополнительным источником азота и углерода и может использоваться в качестве биодобавок к почве.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в качестве модельного соединения для изучения биодеструции ЛС, производных фенола, может служить парацетамол, а актинобактериями деструкторами - штаммы Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767, которые его эффективно метаболизируют.

2. Установлено, что деструкция парацетамола протекает более эффективно при использовании адаптированных к фенолу и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков.

3. Изучена динамика процесса биодеструкции парацетамола с использованием актинобактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767. Установлено, что штамм Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 767 обладает более высокой биотрансформирующей активностью в отношении парацетамола. При использовании свободных клеток родококков R. erythropolis ИЭГМ 767 процесс деструкции парацетамола заканчивается через 10 суток, на адаптированных свободных клетках – через 5 суток, а при использовании иммобилизованных адаптированных клеток в течение 14 часов эксперимента. В тех же условиях скорость трансформация парацетамола клетками R. ruber ИЭГМ 77 значительно ниже.

4. Найдены оптимальные условия разделения парацетамола и возможных продуктов его деструкции методом ТСХ на пластинках Силуфол с использованием систем растворителей: хлороформ-спирт этиловый 95% (8:2) и спирт этиловый 95%-аммиак 25%-вода (80:4:16) при детектировании УФ-светом и в парах йода.

5. Разработаны методики количественного определения парацетамола и п-аминофенола в культуральных средах, позволяющие контролировать процесс биотрансформации: для п-аминофенола – это спектрофотометрическое определение на основе реакции с п-ДМАБА (относительная ошибка не превышает ± 2,09%); для парацетамола – методика с использованием ВЭЖХ (относительная ошибка не превышает ± 4,15%).

6. Изучены физико-химические свойства конечных продуктов процесса биодеструкции парацетамола (шлама): растворимость, температура плавления, значение рН среды. Исследование токсичности и фитотоксичности, показало, что эти продукты нетоксичны для животных и оказывают благоприятное воздействие на растения, что может быть использовано в сельском хозяйстве.

7.На основе проведенных биологических, химических и физико-химических исследований процесса биодеструкции парацетамола предложены технологические схемы утилизации его адаптированными и иммобилизованными клетками родококков и лабораторный регламент, которые реализованы при проведении процесса на ферментационной установке «Фермус – 3».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изучение возможности окислительной биодеструкции лекарственных средств, не пригодных к медицинскому использованию (на примере парацетамола) / Е.В. Вихарева, И.Б. Ившина, Л.А. Чекрышкина, И.И. Мишенина [и др.] // Медико-биологические проблемы Центрального Черноземья: Матер. 69-ой конф. - Курск. - 2004. - С. 292-293.

2. Биодеструкция парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus sensu stricto / Е.В. Вихарева, И.Б. Ившина, И.И. Мишенина, Л.А. Чекрышкина [и др.] // Человек и лекарство: Тез. докл. XI Рос. нац. конгресса. - Москва. - 2004. - С. 16-17.

3. Использование родококков для биодеструкции лекарственных средств / Е.В. Вихарева, И.И. Мишенина, Л.А. Чекрышкина [и др.] // Матер. IX Международ. экологической студенческой конф.: Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ. - Новосибирск. - 2004. - С. 204.

4. Биоконверсия парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus sensu stricto / И.Б. Ившина, Е.В. Вихарева, Л.А. Чекрышкина, И.И. Мишенина [и др.] // Матер. V Международ. науч.-практич. конф.: Здоровье и образование в XXI веке. - Москва. Росс. ун-т дружбы народов. - 2004. - С.148.

5. Изучение биодеструкции парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus / Е.В. Вихарева, Л.А. Чекрышкина, И.И. Мишенина [и др.] // Фармация. - 2004. - № 5. - С. 12-13.

6 Биодеструкция непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств актинобактериями рода Rhodococcus sensu stricto / И.Б. Ившина, М.И. Рычкова, И.И. Мишенина [и др.] // Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико-фармацевтической промышленности: Тез докл. II конф. - Новосибирск, 2004.- С.119-122.

7. Изучение динамики и скорости бактериальной деструкции парацетамола / Е.В. Вихарева, И.И. Мишенина, Ю.В. Данилов [и др.] // Матер. XII Росс. нац. конгресса: Человек и лекарство. – Москва. - 2005. - С. 743.

8. Кинетические параметры процесса биодеструкции парацетамола, непригодного к медицинскому использованию / И.Б. Ившина, М.И. Рычкова, И.И. Мишенина [и др.] // Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биопотенциал: Тез. докл. II Международ. конф. - Пермь-Казань - 2005. -С. 86-87.

9. Деградация парацетамола с истекшим сроком годности свободными клетками актинобактерий / И.Б. Ившина, Л.А. Чекрышкина, И.И. Мишенина [и др.] // Катализ в промышленности. - 2006. - № 2. - С. 44-49.

10. Алканотрофные родококки как катализаторы процесса биодеструкции непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств / И.Б. Ившина, И.И. Мишенина, М.И. Рычкова [и др.] // Журнал прикладной микробиологии и биохимии. - 2006. - Т. 42. - № 4. - С 392-395.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»