WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Исследование парацетамола и продуктов его биотрансформации. Результаты хроматографического исследования показали, что первый метаболит п-АФ появляется в течение первых суток эксперимента при использовании чистых и адаптированных клеток родококков, а в случае применения иммобилизованных клеток появление п-АФ наблюдается уже через 4-6 часов. На штаммах R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77 в процессе биодеструкции парацетамола через 3-е суток эксперимента появляется пирокатехин, через 5 суток гидрохинон и через 7-8 суток обнаруживается бензохинон. На основе литературных и экспериментальных данных биодеструкцию парацетамола можно представить схемой, которая применима к аэробным микроорганизмам, какими являются актинобактерии рода Rhodococcus.

Предполагаемая схема биотрансформации парацетамола

Качественное определение продуктов биотрансформации парацетамола проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках Силуфол и Сорбфил. Из десяти апробированных вариантов составов подвижных фаз эффективное разделение исследуемых веществ наблюдается в системах: спирт этиловый 95%-аммиак 25%-вода (80:4:16) и хлороформ–спирт этиловый 95% (8:2) на пластинках «Силуфол». Исследуемые вещества на хроматограмме обнаруживали путем облучения пластинок УФ-светом или обработкой цветореагентами: железа (III) хлорида 1% спиртовым раствором, п-диметиламинобензальдегида 5% спиртовым раствором, парами йода. На рис. 1 представлена хроматограмма, полученная при разделении модельной смеси продуктов биодеструкции парацетамола в системе: хлороформ–спирт этиловый 95% (8:2).


1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 1. Хроматограмма исследуемых веществ в системе

хлороформ-спирт этиловый 95% (8:2) на пластинках «Силуфол»

1– Парацетамол;

2– п-Аминофенол;

3 – Гидрохинон;

4 – Пирокатехин;

5– Бензохинон;

6– Фенол;

7– Муконовая кислота

8– Модельная смесь продуктов биодеструкции парацетамола

Свойства конечных продуктов биотрансформации парацетамола (шлама) оценивали по физико-химическим свойствам, токсичности и фитотоксичности.

Количественное содержание парацетамола в культуральных жидкостях определяли методом ВЭЖХ на базе лаборатории РИЦ «Фарматест» ПГФА на хроматографе модели HP-1090 (Hewlett Packard, США) и колонке ZORBAX SB- C18 (4,6 х 250 мм, 5 µм), заполненной октадецильной привитой фазой, на приборном комплексе «Милихром А-02» с УФ-детектором. Подвижная фаза - ацетонитрил:вода:натрия дигидрофосфат:натрия октилсульфонат (25 мл : 75 мл : 100 мг: 30 мг); постоянная времени детекции – 0,34 сек; скорость потока элюента – 100 мкл/мин; объем вводимой пробы 5 мкл; режим элюирования – изократический; температура колонки 35°С; длина волны =230 нм; время удерживания парацетамола около 3 мин ± 0,30 мин. Запись и обработку хроматограмм осуществляли с помощью программы «ChemStation». Хроматограммы 0,2% водного раствора парацетамола-стандарта и парацетамола, содержащегося в культуральной жидкости, полученные в этих условиях, идентичны (рис. 2 и 3).

Рис. 2. Хроматограмма

0,2% водного раствора парацетамола-стандарта


Рис. 3. Хроматограмма культуральной жидкости, содержащей 0,2% парацетамола

Содержание п-аминофенола определяли спектрофотометрическим методом на основе реакции конденсации его с п-диметиламино-бензальдегидом при =450 нм на приборе Lambda EZ201 корпорации «Perkin-Elmer». Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерных программ Excel 2003 (Microsoft Inc., 2003), Statistica, версия 6,0 (StatSoft Inc., 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Предварительными исследованиями установлено, что парацетамол, соли ацетилсалициловой и салициловой кислот не являются токсичными для родококков. R. ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767 сохраняют свою жизнеспособность в присутствии исследуемых ЛС в концентрациях от 0,75 до 500 мкг/мл. Другие штаммы по окончании эксперимента были нежизнеспособны или их минимальная подавляющая концентрация (МПК) составляла менее 100 мкг/мл. Из-за низкой растворимости в воде салициловой и ацетилсалициловой кислот необходимо введение в среду 5% водного раствора натрия гидрокарбоната для получения их водорастворимых солей, что требует дополнительной операции и может привести к изменению состава среды культивирования. В связи с этим, в дальнейших исследованиях в качестве модельного соединения для изучения процесса биодеструкции нами избран парацетамол, а в качестве микроорганизмов-деструкторов R. ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767.

Влияние условий культивирования на процесс трансформации парацетамола и активность родококков. Продолжительность эксперимента составляла до 25 суток. Установлено, что уменьшение содержания парацетамола в среде «RS» происходит значительно быстрее как в таблетках, так и в виде субстанции, что возможно, объясняется присутствием в ней аммония сульфата, который является легкоусвояемым для алканотрофных родококков и может служить дополнительным источником аммонийного азота. Скорость биотрансформации парацетамола зависит также от вводимой формы. В таблетированной форме биодеструкция парацетамола в обеих средах происходит значительно быстрее, чем в виде субстанции, вероятно, из-за наличия вспомогательных веществ, которые могли служить дополнительными источниками питания для актинобактерий. Остаточное содержание парацетамола в виде субстанции составляет 1,6% через 20 суток эксперимента в среде «RS» под влиянием R. erythropolis ИЭГМ 767. В то же время полная биодеструкция парацетамола в таблетируемой форме в этих же условиях наблюдается уже на 5-6 сутки (рис. 4). Скорость биодеструкции парацетамола при использовании R. ruber ИЭГМ 77 значительно ниже (рис. 5).

Рис. 4. Изменение содержания парацетамола, введенного в виде субстанции и таблеток, содержащих 0,2 г парацетамола,

R. erythropolis ИЭГМ 767

в среде «RS».

Рис. 5. Изменение содержания парацетамола, введенного в виде субстанции и таблеток, содержащих 0,2 г парацетамола,

R. ruber ИЭГМ 77

в среде «RS».

Появление первого метаболита (п-АФ) обнаруживается на первые сутки эксперимента в обеих средах. Его количественное определение в культуральной жидкости в процессе эксперимента показало, что в первые 5 суток наблюдается увеличение его содержания. По окончании опыта через 25 суток остаточное содержание п-АФ составило около 2 % в среде «RS» и 8 % в среде «К», причем скорость его преобразования актинобактериями R. еrythropolis ИЭГМ 767 выше, чем при использовании штамма R. ruber ИЭГМ 77.

Для исследования влияния каждого из вспомогательных веществ таблеток (крахмала, талька, ПВП или стеариновой кислоты) на скорость и полноту биотрансформации парацетамола в культуральную среду вносили каждое из них в количестве 10% от содержания парацетамола в таблетке. Пробы для количественного определения парацетамола отбирали через 1, 3, 5, 10 и 15 суток.

Как следует из рис. 6 и 7, добавление кислоты стеариновой и ПВП увеличивает скорость биодеструкции парацетамола.

Уменьшение содержания парацетамола в присутствии ПВП происходит значительно быстрее, чем в присутствии стеариновой кислоты. Можно предположить, что ПВП является не только дополнительным источником питания для микроорганизмов, но и катализатором процесса биодеструкции парацетамола.

Рис. 6. Динамика изменения содержания парацетамола в присутствии 10 % количества вспомогательных веществ при использовании

R. ruber ИЭГМ 77.

1 – крахмал; 2 – тальк;

3 – стеариновая кислота;

4 – ПВП

Рис. 7. Динамика изменения содержания парацетамола в присутствии 10 % количества вспомогательных веществ при использовании

R. erythropolis ИЭГМ 767.

1 – крахмал; 2 – тальк;

3 – стеариновая кислота;

4 – ПВП

Влияние вспомогательных веществ таблеток изучено также на рост и жизнеспособность актинобактерий без введения парацетамола. Контроль увеличения биомассы родококков спектрофотометрическим методом (=600 нм) показал, что наиболее благоприятным для роста актинобактерий также являются стеариновая кислота и ПВП, что подтверждает результаты приведенного эксперимента.

Для активизации бактериальных оксигеназ изучен процесс адаптации родококков на феноле, поскольку парацетамол является производным фенола. Пробы отбирали ежедневно в течение 14 суток.


Рис. 8. Динамика роста R. erythropolis ИЭГМ 767

1 - контроль клетки, выращенные на плотной среде;

2 - клетки, адаптированные в парах фенола;

3 - клетки, адаптированные в среде с содержанием 0,1% фенола;

4 - контроль клетки, выращенные в жидкой среде

Установлено, что увеличение биомассы клеток родококков и устойчивая адаптация клеток происходит в жидкой минеральной среде в присутствии 0,1% фенола, находящегося в растворенном виде. На рис. 8 приведена динамика роста биомассы на примере R. erythropolis ИЭГМ 767. Увеличение концентрации фенола более 0,1% замедляет рост биомассы клеток. Предварительная адаптация клеток родококков позволяет повысить устойчивость к окислительному стрессу в процессе биотрансформации парацетамола в сравнении со свободными культурами. Применение адаптированных клеток R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77 сокращает время полной деструкции парацетамола в виде субстанции до 5 суток, а в таблетируемой форме до 3 суток, что оптимизирует процесс по временному параметру и позволяет проводить его без дополнительного внесения инокулята. При использовании R. ruber ИЭГМ 77 или смеси родококков процесс идет с меньшей скоростью (табл. 1 и 2).

Таблица 1.

Результаты количественного определения парацетамола (субстанция) при его биодеструкции адаптированными клетками

Время инкубации, сутки

Содержание парацетамола, %

R. erythropolis ИЭГМ 767

R. ruber ИЭГМ 77

R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77

0

1

2

3

4

5

6

7

8

100,00*

67,89±3,39

35,41±4,06

5,63±2,09

1,82±0,011

0,00

0,00

0,00

0,00

100,00*

92,41±1,26

63,60±2,14

44,91±3,51

36,52±2,45

27,84±1,29

20,16±3,23

17,80±2,11

15,43±1,05

100,00*

77,32±4,23

43,87±2,51

19,40±2,49

9,34±1,08

6,53±0,67

4,03±0,99

0,90±0,007

0,00

Примечание. Каждый результат – среднее из 3-х значений

* За 100% принято введенное количество парацетамола – 0,2 г

Таблица 2.

Результаты количественного определения парацетамола (таблетки) при его биодеструкции адаптированными клетками

Время инкубации, сутки

Содержание парацетамола, %

R. erythropolis ИЭГМ 767

R. ruber ИЭГМ 77

R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77

0

1

2

3

4

5

6

7

8

100,00*

8,97±1,43

1,82±1,09

0,07±0,005

0,03±0,001

0,00

0,00

0,00

0,00

100,00*

58,30±4,85

32,64±3,48

18,42±3,11

9,10±2,02

5,19±1,35

2,72±1,06

0,00

0,00

100,00*

33,01±3,23

15,47±1,05

8,05±1,73

2,12±0,17

0,00

0,00

0,00

0,00

Примечание. Каждый результат – среднее из 3-х значений

* За 100% принято введенное количество парацетамола – 0,2 г

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»