WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

На основании выявленных химико-фармакологических закономерностей выдвигали предположения об участии того или иного вещества или группы веществ в обеспечении фармакологического действия сборов. На основе этого разрабатывали состав нового сбора, предназначенного для профилактики и лечения воспалительных заболеваний почек. Отвар из полученного сбора подвергали фитохимическому анализу методом ВЭЖХ аналогично отварам из ранее изученных сборов.

Морфолого-анатомические признаки сбора изучали с помощью стереомикроскопа МБС – 9 (х28), микроскопов «Биолам» с увеличением малого объектива х135, большого х600 и «Микмед – 6» с увеличением малого объектива х100, большого х400.

Содержание БАВ в сборе определяли методом ВЭЖХ аналогично определению соответствующих соединений в отварах из сборов. Для установления содержания арбутина из сбора получали водное извлечение по методике, приведенной в ГФ ХI издания (статья 26 «Листья толокнянки») с незначительными изменениями (навеска сырья 1 г). Содержание общей суммы флавоноидов и оксикоричных кислот в пересчете на рутин изучали в спиртовом извлечении, полученном по методике, приведенной в ГФ ХI издания (статья 11 «Цветки пижмы») с небольшими модификациями (время экстракции 60 мин).

Определение влажности, содержания золы общей и золы нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте, примесей в сборе, а также степень его измельчения определяли по методикам ГФ ХI издания.

Микробиологическую чистоту сбора определяли по методикам, приведенным в ГФ ХI издания и Изменении №2 (раздел 2) ГФ ХI издания. Сбор отнесен к категории 4А лекарственных растительных средств, применяемых в виде настоев и отваров, приготовленных с использованием кипящей воды.

Исследование радиологической активности сбора и содержания в нем токсичных элементов проводили на базе Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае».

Радиологические свойства сбора оценивали по активности излучения, испускаемого стронцием – 90 и цезием – 137 с использованием программно-аппаратурного комплекса «ПРОГРЕСС 2000» согласно МУК 2.6.1191-03 «Радиационный контроль. Стронций – 90 и цезий – 137. Пищевые продукты. Отбор проб, анализ и гигиеническая оценка».

Содержание в сборе особо токсичных металлов (ртути, мышьяка, свинца, кадмия) устанавливали согласно ГOСТ 30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов».

Исследование фармакологической активности сбора «Нефролен» проводили на 86 белых беспородных крысах обоего пола, массой 150 – 250 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе и свободном доступе к воде и пище. Контрольные и подопытные животные находились в аналогичных условиях и имели примерно одинаковую исходную среднюю массу. Эвтаназию производили согласно правилам, принятым Европейской Конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986).

Из сбора готовили отвар в соотношении 1:10 по методике, приведенной в ГФ ХI издания. Отвар применяли из расчета 500 мг/кг массы тела животного в сутки. Оценку качества отвара проводили по содержанию суммы фенольных соединений в пересчете на арбутин методом ВЭЖХ.

Противовоспалительную активность определяли на экспериментальных моделях острого и хронического воспаления. Моделью острого воспаления служил каррагениновый отек задних лап крыс [Методические указания…, 2000; Тринус Ф.П. с соавт., 1975]. В течение 14 дней крысам подопытной группы вводили отвар исследуемого сбора, контрольной группе – равнообъемное количество воды. После окончания длительного введения крысам, находящимся под легким эфирным наркозом, тонкой иглой под плантарный апоневроз правой задней конечности вводили 0,1 мл 1% раствора каррагенина. Объем лапы определяли онкометрически с помощью плетизмометра до- и через 60, 120 и 240 минут после введения флогистика.

Влияние сбора на развитие пролиферативного воспаления изучали на модели хлопчатобумажной гранулемы [Oronsky A.L. et al., 1967]. Крысам, находившимся под эфирным наркозом, имплантировали стерильные хлопчатобумажные шарики массой 20 мг. В течение 14 дней подопытной группе животных вводили отвар сбора, контрольной группе – равное по объему количество воды. Затем гранулемы извлекали и определяли их влажную и сухую массы. Величина прироста массы шариков служила показателем степени развития гранулематозной ткани. Разность между влажной и сухой массой оценивалась как экссудативный компонент воспалительной реакции.

Для определения антиоксидантной активности исследуемого сбора использовали классическую модель воспаления, вызванного введением формалина [Методические указания, 2000]. Данная модель применяется для активации свободнорадикального окисления при изучении антиоксидантной активности растительных средств [Арбузова Я.С., 2006; Замятина С.В., 2006]. Экспериментальным животным в течение 14 дней вводили отвар исследуемого сбора, контрольной группе – эквиобъемное количество воды. По окончанию введения крысам, находящимся под легким эфирным наркозом, под плантарный апоневроз обеих задних конечностей вводили по 0,2 мл 3% раствора формалина. На третьи сутки производили эвтаназию животных с забором крови. Плазму крови использовали для определения показателей оксидантного статуса. В гемолизате эритроцитов определяли показатели антиоксидантной активности.

Оксидантный статус крови крыс оценивали по уровню находящихся в плазме крови свободнорадикальных прооксидантов (общая прооксидантная активность, ОПА), индуцирующих окисление ТВИН-80, а также по содержанию тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП), представленных преимущественно малоновым диальдегидом.

О состоянии антиоксидантного статуса крови крыс судили по активности трех важнейших внутриэритроцитарных антиоксидантных энзимов: каталазы (КАТ), супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО). Кроме этого, определяли суммарный показатель общей антиоксидантной активности (ОАА), отражающий активность не только внутриклеточных антиоксидантных энзимов, но и неферментных антиоксидантов организма.

При исследовании влияния сбора на функцию почек животные содержались в индивидуальных клетках, что позволяло определять суточный диурез. В собранной моче определяли содержание ионов Na+ и K+ методом пламенной фотометрии. Экскрецию креатинина как показателя, характеризующего скорость клубочковой фильтрации, определяли унифицированным методом Поппера по реакции Яффе [Меньшиков В.В. с соавт., 1987]. Отвар вводили в течение 14 дней. Полученные результаты сравнивали с исходными показателями, которые определяли до введения отвара.

Все результаты фармакологических исследований обрабатывали статистическим методом вариационных рядов с использованием критерия Стьюдента.

Изучение противомикробных свойств водного извлечения из сбора «Нефролен» проводили по методике, приведенной в Изменении № 2 ГФ ХI издания (раздел 3 «Определение антимикробного действия нестерильных лекарственных средств», п. 3.3.1. «Модификация метода Госфармакопеи ХI»), в отношении стандартных тест-штаммов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli (коллекция патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

К наиболее активным фенольным соединениям, проявляющим противовоспалительное, антиоксидантное, противомикробное и диуретическое действие, как правило, относят флавоноиды, фенолокислоты, в том числе оксикоричные кислоты, а также некоторые простые фенолы [Браславский В.Д. с соавт., 1999; Товчига О.В., Штрыголь С.Ю., 2005; Шкарина Е.И. с соавт., 2001; Myagmar B.E. et al., 2004; Tulegenova A. et al., 1999]. Учитывая это, в водных извлечениях из сборов, обладающих фармакологической активностью, было изучено содержание флавоноидов, фенолкарбоновых и оксикоричных кислот, а также некоторых простых фенолов методом ВЭЖХ.

В качестве подвижной фазы использовали 0,1% водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУК) – элюент А и смесь ацетонитрила с 0,1% ТФУК в соотношении 7:3 – элюент В. Объем анализируемой пробы составлял 2 мкл, скорость подачи элюента – 100 мкл/мин, температура колонки – 35С. Подробные условия хроматографирования фенольных соединений приведены в таблице 1.

Качественный анализ всех соединений осуществляли путем сопоставления параметров удерживания пиков, полученных на хроматограммах анализируемых проб с параметрами удерживания пиков, полученных при элюировании стандартных растворов анализируемых веществ. Для дополнительной идентификации в пробы добавляли стандартные образцы, наблюдая увеличение высот предполагаемых пиков определяемых веществ. Кроме этого, сравнивали спектры поглощения в УФ – области стандарта и обнаруженного вещества в анализируемой пробе, записанные при остановленном потоке элюента во время выхода вещества из колонки.

Таблица 1

Условия хроматографирования биологически активных соединений

БАВ

Анализируемая проба

Градиент элюентов

Объем элюирования (мкл)

(длина волны, нм)

Арбутин, гидрохинон

Отвар

5 – 15%

элюэнта В

1500

280

Сумма фенольных соединений, бензойная и салициловая кислоты

Отвар

15 – 55% элюэнта В

2500

280

Сумма флавоноидов и оксикоричных кислот, кверцетин

Отвар*

15 – 55% элюэнта В

2500

360

Сумма оксикоричных кислот, кофейная и феруловая кислоты

Этилацетатное извлечение из отвара*

15 – 55% элюэнта В

2500

360

Рутин

Отвар* после экстракции этилацетатом

15 -55 % элюэнта В

2500

360

Примечание: * - после очистки хлороформом

Количественное определение проводили, используя метод градуировки по внешнему стандарту. Для этого готовили серии разведений стандартных образцов и строили градуировочные графики по результатам хроматографирования в соответствующих условиях (Таблица 1). Суммарное содержание фенольных соединений определяли, используя градуировочный график арбутина, сумму оксикоричных кислот вычисляли по градуировочному графику феруловой кислоты. Для определения суммы флавоноидов использовали разность между суммой площадей пиков хроматограммы отвара до экстракции этилацетатом и суммой площадей пиков хроматограммы этилацетатной фракции соответствующего отвара. Сумму флавоноидов рассчитывали по градуировочному графику рутина.

Фитохимический анализ показал, что отвары из всех сборов содержат арбутин, гидрохинон, рутин, феруловую, бензойную и салициловую кислоты (Таблица 2). При этом их количество колеблется от 0,00008% до 0,046%. Кверцетин обнаружен лишь в трех сборах в количестве не более 0,00004%. По-видимому, это связано с низкой растворимостью флавоноида в воде при нагревании. Кофейная кислота в отварах из сборов не обнаружена. Это может быть связано с ее отсутствием или неустойчивостью к окислительным процессам.

Сумма флавоноидов в отварах из сборов составила от 0,004% (сбор 1) до 0,036% (сбор 3). Различным оказалось и содержание производных коричной кислоты. Наибольшее количество оксикоричных кислот найдено в отваре из сбора 6 (0,034%), наименьшее – в отваре из сбора 2 (0,014%). Сумма всех фенольных соединений в отварах из сборов не превысила 0,8%, при этом максимальное их количество зафиксировано в отваре из сбора 6.

Результаты фитохимического анализа использовали для поиска зависимости фармакологической активности лекарственных сборов от их химического состава. В результате проведенного химико-фармакологического анализа выяснилось, что сборы с высоким содержанием арбутина, флавоноидов и салициловой кислоты обладают более выраженными противовоспалительными свойствами. Сборы с высоким содержанием флавоноидов и оксикоричных кислот проявили лучшие антиоксидантные свойства. Наиболее выраженные противомикробные свойства проявили сборы с высоким содержанием суммы всех фенольных соединений.

Зависимость диуретической активности извлечений из сборов от содержания в них фенольных соединений не обнаружена. Очевидно, это связано с комплексным действием ряда биологически активных соединений, содержащихся в извлечениях из сборов, в том числе соединений, содержание которых нами изучено не было. Так, известно диуретическое действие терпеноидов, карденолидов и некоторых других биологически активных растительных соединений [Б.Н. Головкин с соавт., 2001].

Далее, выявленные химико-фармакологические закономерности использовали при создании нового фитосбора, для которого предполагалось наличие противовоспалительных, антиоксидантных, противомикробных и диуретических свойств. При этом растения подбирались таким образом, чтобы создать в водном извлечении из сбора высокие концентрации арбутина, флавоноидов, салициловой и оксикоричных кислот, которые, как показал химико-фармакологический анализ ранее изученных боров, определяют их фармакологическое действие.

Таблица 2

Содержание биологически активных веществ в отварах из сборов, %

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»