WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Для определения перекисного окисления белков использовали методику Дубининой Е.Е., Бурмистрова С.О., Леоновой Н.В. (1995 г.). Для анализа использовали 0,05-0,1 мл экстракта тканей, осаждение белков осуществляли с помощью 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). К денатурированным белкам приливали равный объем (1мл) 0,1 М 2,4-денитрофенилгидразина (2,4-ДФГ), растворенного в 2 М НСL. В контрольную пробу добавляли вместо 2,4-ДФГ равный объем 2 М HCL. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем пробы центрифугировали при 3000 g в течение 15-20 мин. Осадок промывали 3 раза раствором этанол – этилацетат (1:1). Полученный осадок подсушивали с целью устранения оставшегося растворителя этанол — этилацетат и затем растворяли в растворе мочевины. Мочевину приливали к осадку в объеме 2,5 мл и выдерживали в кипящей бане в течение 5 мин до полного растворения. Оптическую плотность образовавшихся денитрофенилгидразонов измеряли при длине волны 540 нМ.

Перекисное окисление липидов в гомогенатах тканей оценивали по скорости спонтанного и неферментативного аскорбатзависимого ПОЛ, содержанию в тканях конечного продукта ПОЛ – малонового диальдегида (МДА).

Метод определения малонового диальдегида и скорости пероксидного окисления липидов в гомогенатах тканей (Строев Е.А., Макарова Е.Г., 1986) основан на определении содержания конечного продукта ПОЛ – малонового диальдегида, который при взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой образует окрашенный в розовый цвет триметиновый комплекс, имеющий максимум поглощения при =530-532. Навеску тканей 0,5 г гомогенизировали в 19,5 мл охлажденного 1,2% раствора хлорида калия. В одну пробирку наливали 2 мл гомогената и 0,2 мл дистиллированной воды, во вторую – 2 мл гомогената и по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты (2,6 мМ) и соли Мора (4·10-5), в третью – те же вещества, что и во вторую и 1 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты. Все пробы помещали на 10 минут в водяную баню при 37С, после чего в первые две пробирки прибавляли по 1 мл трихлоруксусной кислоты и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Далее отбирали по 2 мл надосадочной жидкости, добавляли по 1 мл 0,8% раствора тиобарбитуровой кислоты и помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 минут. После этого их охлаждали и измеряли экстинцию на фотоэлектроколориметре при 532 нм. Расчет проводили по формулам:

Х1(Х2) = Е1(Е2) х 3 х 3,2 х 6 ; Х3 = Е3 х 3 х 3,2

0,156 х 2 0,156

где Х1 – скорость спонтанного ПОЛ (нмоль МДА/0,05 г/ за час инкубации), Х2 – скорость аскорбатзависимого неферментативного ПОЛ (нмоль МДА/0,05 г за час инкубации), Х3 – содержание МДА в исходном гомогенате (нмоль/0,05 г сырого веса ткани); Е – экстинции соответственно 1-й, 2-й и 3-й проб; 3,2 – общий объем исследуемых проб, мл; 2 – объем надосадочной жидкости, взятой на определение МДА, мл; 3 – объем проб, взятой на фотометрию, мл; 0,156 – экстинция 1 нмоль МДА в 1 мл при 532 нм.

Весь экспериментальный материал обрабатывался статистически с вычислением средней арифметической, ошибки средней, достоверности различий по критерию Стьюдента и проведением корреляционного и дисперсионного анализа с вычислением достоверности силы влияния по Фишеру (Плохинский Н.А, 1980; Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С целью подтверждения развития стресса и выявления возрастных различий в стресс-реактивности экспериментальных животных наряду с поведенческими реакциями изучались некоторые физиологические показатели до и после однократного электрокожного раздражения (табл. 1). В ходе эксперимента у половозрелых крыс наблюдалась выраженная реакция на электро-болевое воздействие со стороны крови и дыхания: частота дыхания увеличилась по сравнению с контролем на 73,1% у половозрелых и на 56,1 у старых животных. Причем частое и глубокое дыхание наблюдали у крыс в течение всего периода воздействия (15 минут) и сразу после извлечения крыс из камеры. По эозинопеническому критерию данное воздействие оказалось стресс-реализующим, что выражалось в значительном снижении числа эозинофильных гранулоцитов в крови половозрелых крыс (на 16%). Анализ крови на содержание адреналина выявил значительное его увеличение после стресса - на 34,8% (половозрелые) и на 16,6% (старые). При этом относительная масса надпочеч­ников достоверно не изменялась, хотя тенденция к ее увеличению наблю­далась у крыс этих двух возрастов (на 10,8% и 11,3%) (табл.1).

Реакция неполовозрелых крыс на ЭКР имела свои особенности. Частота дыхательных движений у них при стрессе понижалась (на 21,2%). В отли­чие от выраженной гипервентиляции у взрослых крыс, у крысят наблюда­ли частое поверхностное дыхание, которое сопровождалось периодическими длительными остановками с видимым спазмом брюшной мускулату­ры. Обращает на себя внимание разница в исходных значениях частоты дыхания (у взрослых - 87,4 ± 3,2, у крысят - 124,0 ± 3,9, р<0,01). Можно по­лагать, что гиповентиляционные эффекты и недостаточная реактивность внешнего дыхания к действию стрессора у неполовозрелых крыс связаны с незрелостью дыхательного центра, его меньшей чувствительностью к углекислому газу и, как следствие этого, быстрым функциональным истощением респираторной системы организма (табл.1).

Реакция крови крысят на ЭКР проявилась в выраженной эозинопении (число эозинофилов снизилось на 41 %) и повышением, хотя намного меньшим по сравнению с половозрелыми и старыми, уровня адреналина (на 5,9%). Исходный уровень катехоламина в крови крысят был значительно выше, чем у взрослых животных. При этом отно­сительная масса надпочечников у крысят достоверно не изменялась и даже наблюдалась тенденция к ее снижению.

Таблица 1

Показатели стресс-реактивности животных разных возрастных групп в условиях острого эмоционально-болевого стресса (М±m)

Показатели

Возраст животных

Неполовозрелые

Половозрелые

Старые

Контроль

Стресс

Контроль

Стресс

Контроль

Стресс

Частота дыхания, мин.

124,0±3,9

97,7±8,4

87,4±3,2

151,3±5,1

87,1±4,56

136,0±3,08

Р

<0.01

<0.001

<0.001

Адреналин мг/мл плазмы

0,0776±

0,001

0,0822±

0,001

0,0453±

0,002

0,0611±

0,004

0,0301±

0,0008

0,0351±

0,0001

Р

<0.05

<0.05

<0.001

Эозинофилы, в 13 мм крови

595,0±18,7

351,8±

23,0

513,3±

17,7

431,4±

21,3

185,0±12,5

461,5±17,1

Р

<0.001

<0.02

>0.05

Масса надпочечников, мг/г

0,0953±

0,003

0,0855±

0,004

0,0775±

0,004

0,0859±

0,003

0,0623

±0,005

0,0694±

0,002

Р

>0.5

>0.05

>0.05

Примечание. Р дано в сравнении с контролем.

Повышение уровня катехоламинов в крови при остром стрессе явля­ется неоспоримым фактом (Филаретов А.А, 1987; Пшенникова М.Г. и соавт., 2000). Различные варианты реакции дыхательной системы на шок, по имеющим­ся в литературе данным, сопровождаются определенными изменениями нейрогормональных взаимоотношений. Так, стресс-вызванные гипервен­тиляционные эффекты (при наличии частого и глубокого дыхания) сопро­вождаются повышением функциональной активности симпатоадреналовой, холин- и серотонинергической систем, а стресс-индуцированная гиповентиляция (при наличии асинхронно частого и по­верхностного дыхания) определяется усилением адренергических процес­сов и падением активности систем ацетилхолин-холинэстераза и серотонин-моноамиоксидаза (Базаревич Г. Я., 1973). Наши данные позволяют сделать заключение о развитии стойкой стресс-реакции взрослых крыс в ответ на действие электрического тока, что подтверждается соответствующими изменениями показателей стресс-реактивности, которые сопровождаются адекватной реакцией со стороны внешнего дыхания. У неполовозрелых животных, наряду с выраженной стресс-индуцированной реакцией крови по гормональному и иммунному компонентам, имеют место гиповентиляционные эффекты при изначально высокой исходной частоте дыхания (табл. 1).

При анализе полученных в ходе экспериментов данных у интактных животных разного возраста нами обнаружены как онтогенетические, так и тканеспецифические особенности пероксидного окисления как белковых компонентов тканей так и липидной пероксидации. Так, уровень конечного продукта ПОЛ в гипоталамусе был более высоким у крысят по сравнению с половозрелыми, при этом у старых животных он заметно отличался от уровня МДА у неполовозрелых. В этой области мозга фоновый уровень ПОБ имел одинаковые значения у взрослых и старых (0,016 нмоль/ч), который превышал величину ПОБ у неполовозрелых крыс. Что касается кинетических характеристик ПОЛ, то скорость индуцированного ПОЛ у взрослых и старых крыс был ровно в два раза ниже, чем у крысят. Уровень спонтанного ПОЛ у половозрелых понизился на 13%, а у старых увеличился на 244% по сравнению с крысятами (табл. 2).

При биохимическом анализе ткани больших полушарий мозга возрастных различий в уровне малонового диальдегида обнаружено не было. При этом, кинетические характеристики ПОЛ имели возрастные особенности: спонтанное ПОЛ повышалось у третьей возрастной группы по сравнению с крысятами и половозрелыми, скорость аскорбатзависимого ПОЛ так же у старых в полтора раза превышала его уровень у молодых и взрослых крыс. Такая же тенденция обнаружена нами и в отношении окислительной деструкции белков в конечном мозге животных.

Исследования показали, что в тканях висцеральных органов имела место достоверная разница в уровне МДА у животных разного возраста, что наблюдалось и в случае с ПОБ. Однако необходимо отметить, что более видимые возрастные отличия изучаемых параметров у интактных животных имели место в легочной ткани для ПОЛ и в легких и миокарде для ПОБ (табл.2).

Далее одной из задач исследования было изучение стресс-чувствительности различных органов крыс разных возрастных групп в отношении свободнорадикального окисления.

На модели острого электрокожного раздражения обнаружены разнонаправленные изменения уровня ПОЛ в различных тканях, причем это касалось как концентрации в гомогенатах тканей МДА, так и кинетических характеристик ПОЛ.

Таблица 2

Уровень перекисной деструкции белков и свободнорадикального окисления липидов в различных органах крыс разного постнатального возраста в условиях острого эмоционально-болевого стресса (M±m)

Воздействие

Неполовозрелые

Половозрелые

Старые

МДА, нмоль/0,05 г ткани

Спонт. ПОЛ, нмоль МДА/ч

Аз.ПОЛ, нмоль МДА/ч

ПОБ, нмоль/ч

МДА, нмоль/0,05 г ткани

Спонт. ПОЛ, нмоль МДА/ч

Аз.ПОЛ, нмоль МДА/ч

ПОБ, нмоль/ч

МДА, нмоль/0,05 г ткани

Спонт. ПОЛ, нмоль МДА/ч

Аз.ПОЛ, нмоль МДА/ч

ПОБ, нмоль/ч

ГИПОТАЛАМУС

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»