WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 11 |

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Введение штаммов возбудителей V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой вызывает в организме биомоделей изменение морфометрических показателей, степень выраженности которых находится в зависимости от полноты набора детерминант вирулентности микроорганизма.
  2. Разработанные алгоритмы проведения комплексных исследований влияния возбудителей V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis на адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей при моделировании инфекционного и вакцинного процессов повышают информативность экспериментального патоморфологического исследования.
  3. Предложенные морфометрические параметры позволяют отбирать штаммы V. cholerae для использования в качестве контрольных при проведении морфологических и иммунологических исследований.
  4. Применение разработанных коэффициентов и индексов для учета состояния трех групп клеточных элементов в слизистой оболочке кишечника объективизирует и стандартизирует оценку качества противохолерных вакцинных препаратов на доклиническом этапе исследований
  5. Морфометрические и морфофункциональные эквиваленты адаптационно-компенсаторных и иммунопатологических реакций у биомоделей характеризуют направленность процессов иммуногенеза при первичном и вторичном иммунных ответах.
  6. Реакция апудоцитов функционально значимых органов биомоделей при инфекционном и вакцинном процессах отражает уровень вовлечения APUD-системы макроорганизма в процесс поддержания его гомеостаза.
  7. В основе повышения объективности оценки безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии на этапах их доклинического изучения лежит широкое применение возможностей базовых аппаратно-программных компьютерных комплексов для денситоморфометрической характеристики состояния клеток и тканей макроорганизма.

Апробация диссертационной работы. Исследования проведены в рамках плановых НИР РосНИПЧИ «Микроб» в период 1999 - 2008 г.г.: 025-99 «Изучение иммунобиологических свойств потенциально вакцинных рекомбинантных штаммов холерного вибриона, несущих гетерологические антигены» № госрегистрации 01.99.0008392; 006-3-01 «Разработка и усовершенствование унифицированных методов оценки безопасности вакцинирующих иммунобиологических препаратов против особо опасных инфекций» № госрегистрации 01.200.111501; 21-4-04 «Патоморфологические аспекты изучения нейроэндокринных механизмов в становлении противохолерного иммунитета» № госрегистрации 0120.0504666; 32-3-08 «Изучение взаимодействия возбудителей чумы, туляремии с организмом хозяина при инфекционном и вакцинальном процессе». Исследование иммуногенных и протективных свойств препаратов «теней» клеток холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп (VCG/O1 c TCP и VCG/O1 без TCP; VCG/O139 c TCP и VCG/O139 без TCP) выполняли в рамках договора РосНИПЧИ «Микроб» с Институтом микробиологии и генетики Университета г. Вены, Австрия (1999-2000); ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы, Блок I «Ориентированные фундаментальные исследования», раздел «Технологии живых систем», подраздел «Защита от патогенов».

Материалы диссертационной работы были представлены на: Всероссийской научно-практической конференции “Новые технологии в медицине”, 13-14 апреля 2001 г., Саратов; Общероссийской конференции с международным участием “Проблемы морфологии”, 14-16 мая 2002 г., г. Сочи; VIII Российской научно-практической конференции по проблеме “Холера”, 4-5 июня 2003 г., г. Ростов-на-Дону; ХIХ съезде физиологического общества им. И. П. Павлова, 19-24 сентября 2004 г., г. Екатеринбург; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов “Окружающая Среда и здоровье”, 19-22 мая 2005 г., г. Суздаль; XXI Российской конференции по электронной микроскопии, 5-10 июня 2006 г., г.Черноголовка; VII Российском съезде врачей-инфекционистов “Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней”, 25-27 октября 2006 г., г. Нижний Новгород; VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в рамках Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств», 3-5 октября 2006 г., г. Оболенск; проблемной комиссии 50.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (50.00) 2000-2006 г.г.; IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-27 апреля 2007 г., г. Москва; VIII конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии”, 27-29 июня 2007 г., г. Москва ; VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ», 25-26 сентября 2007 г., г. Саратов; на научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований» в институте «Микроб», 2000-2008 г.г.

Публикации результатов исследований. Основные положения диссертации изложены в 46 печатных работах, из них 15 статей в рекомендованных ВАК изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 337 листах машинописного текста, состоит из введения, 7-ми глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 201 отечественный и 182 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 89 таблицами и 47 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Штаммы. В работе использовали 38 штаммов микроорганизмов, из них 26 штаммов V. cholerae О1 серогруппы (эльтор и классического биоваров), 4 штамма V.cholerae О139 серогруппы, 6 штаммов Y. pestis, в том числе вакцинный штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ, 2 штамма F. tularensis, в том числе вакцинный штамм F. tularensis 15 линии НИИЭГ.

Препараты. Применяли следующие препараты: коммерческую холерную химическую бивалентную таблетированную вакцину производства РосНИПЧИ «Микроб» (серия 13); коммерческую вакцину Cholera-Impstoff (Lot: 015044.02, Exp.: 05.2000, Swiss Serum Institute); экспериментальные препараты “теней клеток” V. cholerae O1 eltor – VCG/O1 с пилями адгезии (ТСР) и без них; препараты “теней клеток” V. cholerae О139 (VCG/O139) c TCP и без них, приготовленные из штаммов V. cholerae О1 eltor cH1 и V. cholerae O139 AI-1838 (препараты любезно предоставлены доктором В. Любицем, Институт Микробиологии и генетики, Университета г. Вены, Австрия); холерную химическую вакцину, обогащенную ферментами (экспериментально-производственной серии) (РосНИПЧИ «Микроб»; живую чумную вакцину (ЖЧВ) производства ФГУЗ Ставропольского НИПЧИ; вакцину химическую чумную (ХЧВ) (экспериментально-производственной серии № 2) - препарат любезно предоставлен д.м.н. С.М. Дальвадянцем; вакцину туляремийную живую (ЖТВ) производства ФГУП «НПО «Микроген» «Омское предприятие по производству бакпрепаратов», г. Омск (серии 1, 16).

Экспериментальные животные. Работа выполнена на 123 взрослых кроликах породы шиншилла, 110 крольчатах-сосунках, 148 беспородных белых мышах, 255 морских свинках. Объектами морфологического исследования у биомоделей были внутренние органы (сердце, легкие, печень, почки, надпочечники), различные отделы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), лимфоидные органы - селезенка, различные группы лимфатических узлов (регионарные, контрлатеральные и отдаленные), аппендикс, пейеровы бляшки, лимфоидная ткань, ассоциированная с ЖКТ.

Методы. Для изучения культур микроорганизмов использовали общепринятые микробиологические методы. Штаммы холерных вибрионов вводили внутрикишечно крольчатам-сосункам по методу N.K. Dutta и M.K. Habbu [1955], per os белым мышам по методу S.N. Richardson [1984], а также внутрикишечно взрослым кроликам по методу W.M Spira с соавторами [1981]. Штаммы чумного и туляремийного микробов вводили подкожно морским свинкам и беспородным белым мышам.

Противохолерные вакцины вводили взрослым кроликам перорально с помощью зонда. Вакцинные штаммы Y. pestis EV линии НИИЭГ и F.tularensis 15 НИИЭГ вводили морским свинкам подкожно в правую паховую область. Аэрозольную вакцинацию проводили Y. pestis EV линии НИИЭГ морским свинкам в аспирационной дозе 5х105 ж.м.к.

При изучении чистых культур с помощью ПЦР использовали: для Y. pestis - тест-систему «ГенПест» (ТУ- 8895-005-01898109-2007, производства РосНИПЧИ «Микроб») и экспериментальную тест-систему «Мульти-Yp» (РосНИПЧИ «Микроб»); для V. cholerae - тест-систему «ГенХол - Тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом ПЦР» (ТУ 8895-006-01898109-2007, производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб»). Работу выполняли в соответствии с инструкциями к препаратам. Для выявления zot и ace генов V.cholerae использовали праймеры, предложенные A. Basu et al.(1998), параметры и условия реакции амплификации - Н.А. Давыдовой с соавторами (1999).

Иммунологические показатели после введения противохолерных вакцин определяли в сыворотках крови иммунизированных животных в различные сроки. Агглютинины выявляли по общепринятой методике, титры вибриоцидных антител устанавливали микрометодом [Benenson A.S. et al., 1968], антитела к холерному токсину, О-антигену и ферментам - в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием моноспецифических адсорбированных кроличьих сывороток. После введения противочумных вакцин сывороточные антитела к F1 чумного микроба определяли в трехкомпонентной реакции нейтрализации антигена (РНАГ) с диагностикумом эритроцитарным чумным иммуноглобулиновым сухим и в тесте активной защиты животных [МУ 3.3.1.1113-02].

После введения штамма – кандидата в холерные вакцины определяли количество апоптотических и пролиферирующих эукариотических клеток на импульсном проточном цитофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия).

Для гистологического исследования биоматериал фиксировали в 10 %-ом водном нейтральном растворе формалина и далее проводили по общепринятой в гистологии схеме обезвоживание и заливку его в парафин [Меркулов Г.А., 1969]. Из полученных парафиновых блоков на санном микротоме готовили полутонкие срезы (толщиной 4-5 мкм), которые окрашивали: гематоксилином и эозином [Лилли Р., 1969], альциановым синим и Шифф-реактивом [Пирс Э., 1962], суданом IV и осмиевой кислотой [Лилли Р., 1969], ОКГ (оранжевым-красным-голубым) [Зербино Д.Д., Лукасевич Л.Л., 1984], по методу Севки [Пирс Э., 1962], импрегнировали срезы серебром по Массону в модификации Гамперля [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996], по Гримелиусу (1968), по Мозеру (1995), микробные клетки окрашивали по Николя [Меркулов Г.А., 1969]. Готовые гистологические препараты просматривали в световом микроскопе МБИ-15 с фотоприставкой или биологическом микроскопе Olimpus CX 31 с видеокамерой JVC.

Количество отдельных клеточных элементов (лимфоциты, нейтрофилы, эозинофилы, плазматические клетки, макрофаги, фибробласты) определяли на 100 клеток клеточного инфильтрата в 10 полях зрения правильно ориентированных срезов кишечника при увеличении Х 400. Конечный результат (среднеарифметическое значение) выражали в процентах. Количество межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) тонкого кишечника и лимфоцитов покровного эпителия толстого кишечника определяли на 1000 ядер энтероцитов при увеличении Х 200. Общее количество бокаловидных клеток подсчитывали на 100 ядер эпителиоцитов в 10 повторах при увеличении Х 200, определяя их секреторный профиль по количеству клеток, дающих голубую (кислые мукополисахариды - КМПС), красную (нейтральные мукополисахариды - НМПС) или фиолетовую (смешанные формы) окраску, в 100 секреторных клетках. Количество апудоцитов определяли в 10 полях зрения правильно ориентированных срезов кишечника, лимфоидных органов (селезенка, мезентериальные лимфатические узлы, пейеровы бляшки), легочной ткани, мозгового вещества надпочечников при увеличении Х 200 - Х 400. Морфофункциональное состояние клеток оценивали по изменению интенсивности окрашивания и зоне распределения продукта секреции в клетке, выявляемых в гистохимических реакциях и подтверждаемых изменениями на электронограммах. Количество апудоцитов в состоянии различной функциональной активности определяли по формуле: Ру = Ух100/n, где Ру - процент клеток в том или ином морфофункциональном состоянии, У - количество клеток в данном морфофункциональном состоянии, n - общее число апудоцитов.

Подсчет апоптозных ядер проводили при увеличении Х 900, в 5-ти повторах, так чтобы анализу был подвергнут материал, включающий не менее 1000 клеток.

Степень активности отдельных структур лимфоидных органов и селезенки (Т- и В-зон) оценивали полуколичественным методом по 3-х балльной шкале (от 0 до 3): 0 баллов - отсутствие активности; 1 балл - слабо выраженная активность; 2 балла - умеренно выраженная активность; 3 балла- резко выраженная активность.

Состояние паренхиматозных клеток оценивали: по изменению ядерно-цитоплазматического индекса (ЯЦИ), деструктивного индекса (ДИ), определяемого по удельному весу в клеточной популяции элементов с проявлениями цитопатологии. Функциональное состояние дыхательной системы характеризовали по изменению перфузионно - вентиляционного отношения (ПВО).

Для выявления взаимосвязанной оценки отдельных звеньев гомеостаза, конкретные морфометрические параметры представляли в виде разработанных нами ассоциаций показателей в форме различных индексов.

Стрессорный индекс (Истресс.) вычисляли по формуле:

Истресс. = Шкоры /.Шмозг.,

где Шкоры - ширина коркового,.Шмозг - ширина мозгового вещества надпочечников у исследуемой биомодели.

Коэффициент адаптации (Кадап.) вычисляли по формуле:

Кадап. = Истресс.оп. / Истресс.контр.,

где Истресс.оп. - величина стрессорного индекса у животных опытной группы, Истресс.контр - аналогичный показатель в группе интактных контрольных животных.

Индекс регенеративной активности (ИР) вычисляли по формуле:

=

Коэффициент активности апудоцитов (КА) вычисляли по формуле:

=

где Иап – индекс активности апудоцитов определяемый по формуле:

=

Коэффициент секреторной активности (КС) вычисляли по формуле:

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 11 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»