WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Для определения влияния БП на транскрипционную активность NF-kB в культурах клеток гепатомы Г-27 и HepG2 мы трансфецировали клетки плазмидой, содержащей ген-репортер люциферазы под контролем NF-kB- чувствительного промотора, с последующим определением активности люциферазы по стандартному протоколу.

В клетках Г-27 транскрипционная активность NF-kB в 3,6 раз возрастает по сравнению с контролем после культивирования клеток в течение 24 часов с БП. Культивирование клеток Г-27 с неканцерогенным БеП не влияло на транскрипционную активность NF-kB.

В культуре клеток HepG2 канцерогенный БП и его некацерогенный аналог БеП не влияли на транскрипционную активность NF-kB. В качестве положительного контроля клетки культивировались с известным активатором NF-kB – TNF-. Активация TNF- свидетельствует о том, что отсутствие эффекта БП не связано с отсутствием в клетках HepG2 белка NF-kB.

Для более детального изучения действия БП на активацию NF-kB мы исследовали активацию NF-kB с целью оценки способности связывания с консенсусным олигонуклеотидом.

б. Влияние ПАУ на активацию NF-kB, определяемую методом EMSA.

Как и в предыдущем разделе, мы сравнили действие канцерогенного БП и неканцерогенного БеП на активацию NF-kB в клетках гепатомы Г-27 и HepG2.

Клетки обрабатывались изучаемыми веществами в количестве 5 мкг/мл среды, а затем проводилась реакция связывания фракции ядерных белков, выделенных из клеток, с консенсусным олигонуклеотиом к NF-kB (см. рис. 6). Реакция с антителами (супершифт) показала, что обработка клеток БП вызывает связывание двух комплексов NF-kB- р50/р50 и р65/р50 (см. рис. 6).

Как показано на рис. 6, после добавления к клеткам Г-27 БП через 30 минут наблюдается усиление связывания NF-kB, которое достигает максимума через 60 минут после добавления. Через 90 минут после добавления БП к клеткам Г-27 связывание ослабевает.

Обработка БП клеток HepG2 вызывает увеличение связывания NF-kB, хотя в очень слабой степени, также через 30 минут после добавления (см. рис. 6).

Неканцерогенный аналог БП – БеП, как показывает рисунок 7, вызывает очень слабое усиление связывания через час после добавления к клеткам. В качестве положительного контроля активации NF-kB был использован его известный активатор TNF-. Как видно из диаграммы (рис. 7б), максимальная активация NF-kB при действии БП составляет 50% активации, вызванной TNF-.

Традиционный путь активации NF-kB предусматривает зависимое от фосфорилирования потеолитическое удаление ингибирующего белка IkB. Поэтому мы решили исследовать уровень фосфорилированного IkB после воздействия БП. Обработка клеток Г-27 БП увеличивает уровень фосфорилированного IkB через 30 минут после воздействия. Деградация общего IkB наблюдается после 60 минут после воздействия БП. Для положительного контроля клетки обрабатывались известным активатором NF-kB – TNF-, который вызывал более сильное фосфорилирование IkB.

Из полученных результатов видно, что в отличие от клеток Г-27 с отсутствием системы метаболизма, в клетках с экспрессией ферментов метаболизма и Ah-рецептора HepG2, отмечается более слабая активация NF-kB. Из этого можно заключить, что БП активирует NF-kB, находясь в исходной неметаболизированной форме и для его действия нет необходимости в активации Ah-рецептора. Предыдущими исследователями показано, что NF-kB взаимодействует с неактивированным Ah-рецептором. В результате, по-видимому, NF-kB будучи связан с Ah-рецептором не может быть активирован. Поэтому в системе, где присутствует Ah-рецептор (гепатома HepG2) NF-kB не активируется лигандом, а в отсутствии Ah-рецептора (гепатома Г-27) наблюдается активация при действии БП.

5. Влияние ПАУ на активацию АР-1.

АР-1 является транскрипционным фактором способным, влиять на клеточную пролиферацию благодаря регуляции экспрессии и функции таких регуляторов клеточного цикла как циклины D1, А, Е, белки р53, р21, р15, р19. АР-1 активируется при различных стимулах клеточной пролиферации.

Нами было проведено исследование по влиянию БП на активацию транскрипционного фактора АР-1 в клетках гепатомы HepG2 с экспрессией цитохрома Р450 и Ah-рецептора и в клетках гепатомы Г-27, в которой отсутствует экспрессия цитохрома Р450 и Ah-рецептора.

Рисунок 8 демонстрирует, что в клетках гепатомы HepG2 БП усиливает связывание АР-1 через час после воздействия и достигает максимума через 2 часа. Обработка клеток гепатомы Г-27 БП не вызывает усиления связывания АР-1.(см. рис. 8)

Из этого следует, что активация АР-1 при действии лигандов Ah-рецептора связана с активацией исключительно Ah-рецептора и/или образованием активных метаболитов и цитохрома Р450, и наблюдаемые нами эффекты канцерогенных ПАУ в клетках с отсутствием Ah-рецептора и цитохрома Р450 не распространены на активацию АР-1.

6.Влияние ПАУ на образование активных форм кислорода. (АФК)

Одним из механизмов опухолевой промоции является образование АФК в клетке. Считается, что с формированием АФК связаны такие промоторные эффекты как ингибирование МЩК и стимуляция пролиферации.

Образование АФК в клетке под действием промотора и разнообразных индукторов цитохрома Р450 (Akintobi et al., 2007; Jin et al., 2004) может быть обусловлено функционированием цитохрома Р450, однако, в клетках гепатомы Г-27 отсутствует экспрессия цитохрома Р450. В том числе не исключено, что формирование АФК может происходить в результате изменения других клеточных систем, продуцирующих АФК (например, дыхательная цепь митохондрий).

Возможность образования АФК в клетках гепатомы Г-27 под действием БП мы исследовали с помощью маркерного соединения дихлородиацетилфлуоресцеина (см материалы и методы).

Мы показали, что ни БП, ни его неканцерогенный аналог не вызывают увеличения уровня флуоресценции в клетках гепатомы Г-27, что свидетельствует об отсутствии образования АФК под действием БП.

Из этих данных можно заключить, что описанные выше эффекты ПАУ на функции клеток (ингибирование МЩК, активация транскрипционных факторов АР-1 и NF-В) не связаны с образованием АФК.

ВЫВОДЫ.

1. Модель клеточной культуры гепатом с экспрессией Ah-рецептора и цитохрома Р450 (HepG2) и без таковой (Г-27) является наиболее перспективной для изучения механизмов опухоль-промоторного эффекта полициклических ароматических углеводородов (ПАУ).

2.Стадия промоции является определяющей в развитии опухоли при действии ПАУ. Эффект канцерогенных ПАУ реализуется в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях.

3. Канцерогенный эффект ПАУ обусловлен действием исходным (химически-инертным) состоянием его молекулы.

4. Используемые в работе канцерогенные ПАУ (БП- бензо/а/пирен, 3-МХ - 3-метилхолантрен, ДМБА – 7,12-диметилбенз/а/антрацен) и неканцерогенный аналог бензо/е/пирен оказывают различное влияние на функциональную активность межклеточных щелевых контактов (МЩК) гепатом, экспрессирущих (HepG2) и неэкспрессирующих (Г-27) Ah-рецептор и изоформы цитохрома Р450. При этом:

а) Канцерогенные ПАУ (в отличие от неканцерогенных) ингибируют МЩК в клетках обоих типов гепатом.

б) БП вызывает наиболее сильный ингибирующий эффект на МЩК по сравнению с другими изучаемыми канцерогенами.

в) В обеих клеточных культурах (Г-27 и HepG2) ингибирующее действие бензо/а/пирена на состояние МЩК не зависит от функционирования Ah-рецептора.

5. Ингибирование МЩК в клетках гепатомы Г-27 под воздействием БП сочетается с падением уровня белка-супрессора р21, а в клетках гепатомы HepG2 с падением уровня белка-супрессора р27. Это свидетельствует о различных механизмах стимуляции клеточной пролиферации в указанных гепатомах.

6. В клетках гепатомы HepG2 (с экспрессией цитохрома Р450 и Ah-рецептора) бензо/а/пирен активирует транскрипционный фактор АР-1, тогда как эффект активации транскрипционного фактора NF-kB не наблюдается. В клетках гепатомы Г-27 (с отсутствием экспрессии цитохрома Р450 и Ah-рецептора) бензо/а/пирен стимулирует активацию транскрипционного фактора NF-kB, а активация транскрипционного фактора АР-1 отсутствует. Таким образом, механизмы влияния бензо/а/пирена на такие составляющие опухолевой промоции, как стимуляция пролиферации и апоптоз, зависят от экспрессии в клетках цитохрома Р450 и Ah-рецептора.

7.Действие канцерогенного бензо/а/пирена а также его неканцерогенного аналога не вызывает образования активных форм кислорода в клетках гепатомы Г-27. Из этого следует, что вышеописанное влияние ПАУ на различные функции клеток гепатом (подавление функциональной активности МЩК, активация транскрипционных факторов NF-kB и АР-1) не связаны с образованием активных форм кислорода.

8. Полученные данные являются основанием для предположения о существовании (кроме Ah-рецептора и цитохрома Р450) в клетках исследуемых гепатом фактора, при взаимодействии с которым канцерогенных ПАУ нарушается гомеостаз, приводящий к промоции.

Практические рекомендации. Целесообразно включение результатов исследования в практику научно-исследовательских подразделений, разрабатывающих проблемы канцерогенеза и лекционные курсы по гистологии и онкологии медицинских ВУЗов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шаровская Ю.Ю., Соломатина (Болотина) Н.А., Дубовая Т.К., Хитрово И.А., В.А.Кобляков. Ингибирование межклеточных щелевых контактов (ЩК) канцерогенными полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) в культуре клеток в отсутствии метаболического превращения ПАУ./ Сборник научных трудов ГОУ ВПО «Смоленская Государственная Медицинская Академия МЗ РФ», 2004, с. 245-249.

2. Шаровская Ю.Ю., Вайман А.В., Соломатина (Болотина) Н.А., Кобляков В.А. Ингибирование межклеточных щелевых контактов канцерогенными полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) в культуре клеток в отсутствии метаболического превращения ПАУ.// Биохимия - 2004, 69: 4, 511-518.

3. Kobliakov V., Solomatina (Bolotina) N., Vaiman A., Sharovskaya Y. Inhibition of gap junction intercellular communications (GJIC) and stimulation of cell proliferation in cell culture by carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in the absence of PAH metabolism.// 18th Meeting of the European Association for Cancer Research, Proceedings, 2004, 105.

4. Кобляков В.А., Соломатина (Болотина) Н.А., Шаровская Ю.Ю. Механизм промоторного действия «полных» канцерогенов.// Вопросы онкологии – 2005, 51:1, 11-12.

5. Соломатина (Болотина) Н.А., Гаспарьян А.В., Дубовая Т.К., Кобляков В.А. Активация транскрипционных факторов NF-kB и АР-1 в клетках гепатом канцерогеном бензо/а/пиреном.// Цитология – 2006, 48:9, 801-802.

6. Sharovskaya Y., Kobliakova Y., Solomatina (Bolotina) N., Kobliakov V. Effect of some carcinogenic and non-carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons on gap junction intercellular communications in hepatoma cell cultures.// European Journal of cell Biology, 2006, 85: 387-397.

7. Болотина Н.А., Гаспарьян А.В., Дубовая Т.К., Евтеев В.А., Кобляков В.А., Активация бензо/а/пиреном транскрипционных факторов NF-kB и АР-1, связанных с промоторной стадией канцерогенеза в культуре клеток// Биохимия – 2007, 72: 5, 682 – 689.

8. Кобляков В.А., Волков М.С., Гаспарьян А.В., Евтеев В.А., Болотина Н.А. Закономерности промоторной стадии канцерогенеза// Цитология – 2007, 49:9, 756.

9. Гаспарьян А.В., Евтеев В.А., Болотина Н.А., Кобляков В.А. Механизмы негенотоксического действия канцерогенов// Вопросы онкологии, 2007, 63, 10-11.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»