WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Для контроля за эффективностью и потенциальной токсичностью процедуры трансфекции применялась котрансфекция клеток плазмидой, содержащей ген -галактозидазы. Клетки выращивались на 24-луночной плашке и на стадии формирования 50-70% монослоя трансфецировались плазмидами. В качестве трансфекционного агента использовался PolyFect (Qiagen). Через сутки после трансфекции клетки инкубировались в течение 24 часов с исследуемыми ПАУ в концентрации 5 мкг/мл среды. Далее клетки лизировались как описано ранее (см. Электрофорез и Иммуноблотинг).

Активность люциферазы измерялась по стандартному протоколу (Promega, США) на люминометре Turner BioSistems 20/20n (США).

Активность -галактозидазы измерялась по стандартной методике, основаной на использовании в качестве субстрата -галактозидазы ONPG (О-нитрофенил-b-D-галактопиранозидазы) (Sigma-Aldrich). Расчет относительной активности люциферазы проводили в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактозидазы в исследованных образцах).

Определение влияния ПАУ на образование активных форм кислорода (АФК) в клетках гепатомы Г-27. Клетки выращивали на 60 миллиметровых чашках до монослоя 80%. За сутки до исследования к клеткам добавлялся БП или БеП. Затем к ним добавлялся флуоресцентный краситель диацетилдихлорофлуоресцеин до конечной концентрации 10 микромолей на миллилитр среды, клетки инкубировались с красителем в течение 30 минут при 37о С. Контрольные клетки после инкубирования с красителем промывались теплым раствором Хенкса и инкубировались с перекисью водорода 45 минут при 37о С в концентрации 2 милимоля на миллилитр среды. Среда сливалась, клетки снимались холодным Версеном и переносились в холодный раствор Хенкса. Диацетилдихлорофлуоресцеин при проникновении в клетку и взаимодействии с АФК, например, такими как перекись водорода, гидроксильный и супероксидный радикалы, окисляется ими до флуоресцентного соединения.

Уровень образования АФК в клетках гепатомы Г-27 определяли методом проточной цитофлоуметрии после окраски клеток красителем дихлородиацетилфлуоресцеином в цитометре FACSCalibur (Becton Dicinson, USA).

Дальнейшую компьютерную обработку данных проводили с помощью программы WinMDI 2.9 (Joseph Trotter, La Jolla, CA, USA).

Результаты исследований и их обсуждение.

1.Ингибирование межклеточных щелевых контактов при действии ПАУ в культуре клеток HepG2.

Как ранее упоминалось, одним из событий опухолевой промоции является нарушение межклеточных щелевых коммуникаций (МЩК). С целью изучения действия ПАУ на МЩК были выбраны клетки гепатомы человека HepG2 с достаточно высоким для опухолевых клеток уровнем функциональной активности МЩК.

Как видно из рисунка 1, люциферовый желтый эффективно окрашивает рядом лежащие клетки, в которые ввели краситель. Рисунок 1(с,d) демонстрирует, что часовая экспозиция бензо/а/пирена (БП) в концентрации 5мкг/мл вызывает значительное подавление перетекания красителя в соседние клетки. Было установлено, что после часа воздействия БП отмечается выраженный (более 80%) эффект ингибирования МЩК (см. рис. 1), 3-метилхолантрен (3-МХ) демонстрирует слабый ингибирующий эффект на МЩК (см. таблица 1). Для исследуемых канцерогенов эффект ингибирования МЩК вызывали при 24 часовом воздействии на клетки. Наиболее сильный ингибирующий эффект продемонстрировали БП (до 100%) (см. рис. 1) и 7,12-диметилбенз/а/антрацен (ДМБА) приблизительно - 75% (см. таблица 1). Неканцерогенный бензо/е/пирен (БеП) ингибировал МЩК после часа икубирования на 10% и на 19% после суток воздействия (см. таб.1; см. рис. 1).

Эффект БП на ингибирование МЩК в культуре клеток гепатомы HepG2 зависел от его концентрации. Эффект БП становится выраженным при концентрации 0,6мкг/мл.

Как известно, одним из свойств опухолевых промоторов является обратимость их действия после прекращения воздействия. Этот феномен, характерный и для ПАУ, был продемонстрирован на примере БП. После инкубирования клеток в течение часа в среде с концентрацией БП 1.25мкг/мл путем трехкратной смены культуральной среды вещество удалялось. В результате этого отмечалось восстановление МЩК с 29.4% до 65% по сравнению с контролем. Частичное восстановление МЩК можно объяснить только высокой липофильностью БП, так как полное его удаление из клеточной мембраны требует более длительной отмывки.

Для ответа на вопрос, связано ли нарушение функционирования МЩК под действием ПАУ с образованием их активных метаболитов, был исследован эффект ингибитора метаболизма ПАУ (-нафтофлавона) на блокирование МЩК 3-метилхолантреном (3-МХ). Как видно из рисунка 2, сам -нафтофлавон (-НФ) не влияет на МЩК и не изменяет ингибиторного эффекта 3- метилхолантрена. Таким образом, ингибиторный эффект ПАУ на МЩК не связан с формированием его активных метаболитов.

Таблица 1 Эффект различных ПАУ на прницаемость МЩК в клетках гепатом HepG2 и Г-27 при экспозиции 1ч и 24 ч. Эффект выражен в % окрашенных клеток к контролю.

ПАУ(5мкг/мл)

Клетки

Время воздействия

1час

24 часа

бензо/а/пирен (20М)

HepG2

12.9 ±1.3

0

7,12-диметилбнзантрацен (20М)

HepG2

98.9±1.1

36.3±0.7

3-метилхолантрен (19М)

HepG2

98.3 ±1.2

21.8 ±0.5

-нафтофлавон (5М)

HepG2

108.1 ±12.6

-нафтофлавон (5М)+

3-метилхолантрен (19М)

HepG2

21.7 ±5.3

бензо/е/пирен (20М)

HepG2

91.5 ±8.8

81.0 ±1.0

бензо/а/пирен (20М)

Г-27

11.5 ±3.4

0

В контроле за 100% принимается среднее (из 7-11 инъекций) количество окрашенных

соседних клеток через 2 минуты после инъекции красителя в одну из клеток монослоя. В контроле для клеток HepG2 среднее количество окрашенных клеток составляет 11, а для Г-27 – 7 клеток.

2. Ингибирование межклеточных щелевых контактов ПАУ в культуре клеток Г-27.

Для ответа на вопрос о роли метаболизма ПАУ и Аh-рецептора в эффекте бензо/а/пирена (БП) на функцию МЩК мы использовали культуру клеток гепатомы Г-27, в которой, как было показано, отсутствует экспрессия изоформ цитохрома Р450 и Аh-рецептора. Рис 3(а,b) демонстрирует перетекание красителя в клетках гепатомы Г-27 без воздействия, а рис. 3(с,d) показывает ингибирование перетекания красителя при воздействии 5 мкг/мл БП в течение 1 часа. Экспозиция БП клеток гепатомы Г-27 в течение 24 часов вызывает ингибирование МЩК на 100% (см. таблица 1). Неканцерогенный БеП в дозе 5 мкг/мл в течение 1 часа и 24 часов не влиял на функционирование МЩК. (рис. 3 e,f; g,h)

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что ингибирование МЩК канцерогенными ПАУ осуществляется исходной неметаболизированной молекулой и не зависит от его взаимодействия с Ah- рецептором.

Концентрационная зависимость действия БП на ингибирование МЩК в клетках гепатомы Г-27 идентична тому, что показано для клеток гепатомы HepG2, из чего можно сделать заключение, что в клеточных культурах обоих типов гепатом эффект БП вызывается действием через один и тот же клеточный центр. В клетках гепатомы Г-27 отсутствует экспрессия как цитохрома Р450, так и Ah-рецептора. Таким образом, можно заключить, что механизм действия БП не связан с ранее известными механизмами действия, такими как активация Ah-рецептора и функционирование цитохрома Р450.

Различия в действии БП и неканцерогенного БеП может быть связано с неодинаковым накоплением этих веществ в цитоплазматической мембране клетки. Для проверки данного предположения мы измерили уровень БП и БеП в клетках после 1 и 24 часов воздействия. Из таблицы 2 видно, что накопление ПАУ в клетках зависит от времени и количества БП и БеП, выделенных из клеток, значительно больше после 24 часов воздействия, по сравнению с 1 часом.

Таблица 2. Определение степени накопления ПАУ в клетках гепатомы Г-27.

ПАУ

Концентрация мкг/мл

БП и БеП, выделенные из клеток (нг/миллион клеток)

Время

1 час

24 часа

Бензо/а/пирен

5.0

136.6 ± 22.2

237.8 ±24.6

Бензо/а/пирен

1.25

37.0 ±16.3

135.7 ±32.1

Бензо/а/пирен

0.6

33.0 ±12.2

50.0 ±16.8

Бензо/е/пирен

5.0

603.0 ±58.6

1356.0 ±64.0

Таким образом, зависимое от времени возрастание ингибирования МЩК в результате воздействия ПАУ связано с увеличением накопления этих соединений в клетке. Более эффективное накопление БеП в клетках свидетельствует о том, что различный эффект при воздействии БП и БеП на МЩК не является результатом степени их накопления в клеточной мембране.

3. Влияние ПАУ на экспрессию белков р21 и р27.

Белки р21 и р27 относятся к семейству белков-супрессоров семейства Cip/Kip, количество которых увеличивается на стадии G0 и уменьшается при получении клеткой митотического стимула. Как было показано в предыдущем разделе, БП вызывает стимуляцию пролиферации и снижает функциональную активность МЩК. Мы предположили, что эти эффекты могут сопровождаться изменениями уровня белков семейства Cip/Kip.

Для исследования действия БП на уровень белков р21 и р27 клетки культивировались в течение суток без сыворотки для приостановки их роста, а затем добавлялась сыворотка в качестве контроля и БП на 4, 8 и 24 часа.

Рисунок 4а показывает, что в клетках гепатомы Г-27 уровень белка р21 начинает падать после 4 часов воздействия БП и достигает своего минимума после 8 часов воздействии БП по сравнению с контролем. Из диаграммы на рис. 4б видно, что через 8 часов после воздействия БП уровень белка р21 уменьшается на 50% по сравнению с контролем.

Уровень белка р27 в клетках гепатомы Г27 в результате действия БП не меняется ни в одной из исследованных временных точках.

Как показывает рисунок 5а, уровень белка р27 в клетках гепатомы HepG2 падает через 8 часов приблизительно на 30% (рис. 5б) после воздействия БП по сравнению с контролем.

Уровень р21 в клетках гепатомы HepG2 не меняется ни в одной из временных точек.

Таким образом, подавление функции МЩК в клетках гепатомы Г-27 под воздействием БП сочетается с падением уровня белка р21, а в клетках гепатомы HepG2 с падением уровня белка р27.

4. Влияние ПАУ на активность NF-kB.

а. Влияние ПАУ на транскрипционную активность NF-kB, определяемую методом транзиторной трансфекции.

NF-kB является транскрипционным фактором, контролирующим такие важные клеточные процессы как, пролиферация клеток и апоптоз. Помимо этого, NF-kB влияет на способность опухолевых клеток к метастазированию и на ангиогенез.

В настоящее время в литературе недостаточно сведений о влиянии ПАУ на экспрессию NF-kB. Считается, что активация NF-kB может играть определенную роль в промоции.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»