WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Таблица 2. Влияние мутации гена SuUR на ЭПМ гена yellow+ в «минихромосоме» Dp(1;f)1187

Частоты щетинок yellow,%

25оC

18oC

Генотип F1

y; Dp(1;f)1187, y+;SuUR +

4,7

4,4

8,3

8,4

y; Dp(1;f)1187, y+;SuUR-/ SuUR +

1,3

2,1

1,1

1,3

Линия y; Dp(1;f)1187, y+;SuUR-

0,44

0,46

--

--

y; Dp(1;f)1187, y+; ru,h,SuUR+/ SuUR+

--

--

--

9,0

y; Dp(1;f)1187, y+; ru,h,SuUR-/SuUR +

--

--

--

1,3

р0,99 р0,99 р0,99 р0,99

У гомозигот по мутации SuUR мы наблюдали уменьшение числа жёлтых щетинок, что говорило об ослаблении ЭПМ по сравнению с контрольными классами. При температуре 18С, усиливающей ЭПМ гена yellow+, супрессирующее влияние мутации SuUR на ЭПМ становилось более заметным. Мы показали эффект мутации SuUR не только в гомозиготе, но и в гетерозиготе, что позволяет сделать заключение о полудоминантности эффекта SuUR.

Аналогичные результаты получены для супрессии ЭПМ гена scute в инверсии In(1)sc8.

В целом, полученные данные характеризуют ген SuUR как гапло-супрессор ЭПМ. Многие гены гапло-супрессоры ЭПМ проявляют себя как энхансеры ЭПМ в дополнительных дозах, поэтому следующей задачей было изучить влияние дополнительных доз и оверэкспрессии SuUR на ЭПМ.

Для оценки степени влияния на ЭПМ оверэкспрессии SuUR мы использовали линию, содержащую транспозон H7, несущий полноразмерный ген SuUR под контролем промотора теплового шока (Makunin et al., 2002). Измерили оптическую плотность экстрактов глазного пигмента потомков от скрещивания самок y,w;H7-X;H7-3 с самцами wm4h;ru,h,SuUR+. Оверэкспрессия SuUR достигалась с помощью серийного теплового шока. Для контрольных измерений использовали потомков этого же скрещивания, но прошедших всё развитие при температуре 25oC. Как следует из данных в Таблице 3 оверэкспрессия SuUR усиливает ЭПМ гена white: количество красного пигмента уменьшается.

Таблица 3. Влияние оверэкспрессии SuUR на ЭПМ гена white+ в In(1)wm4h

Температура развития

OD480

Генотип F1

y,w,H7-X / wm4h;H7-3/ru,h,SuUR+

25oC

0,388 ± 0,020

тепловой шок

каждые 12 часов

0,138 ± 0,010

р0,99

Усиление репрессии генов при ЭПМ наблюдалось и при введении дополнительных доз гена SuUR в линии с дупликацией Dp(1;f)1187

Полученные данные позволяют заключить, что ген SuUR является модификатором ЭПМ и его влияние на ЭПМ зависит от дозы гена.

Корреляция локализации белка SUUR с изменением морфологической структуры района, подверженного ЭПМ. Поскольку для белка SUUR характерна локализация в гетерохроматиновых районах, мы хотели выяснить, появляется ли белок SUUR в районах, претерпевающих гетерохроматизацию при ЭПМ. Для этого мы использовали перестройку Dp(1;1)pn2b, которая наилучшим образом демонстрирует различную степень гетерохроматизации района, подверженного ЭПМ (Belyaeva, Zhimulev, 1991).

На цитологических препаратах степень компактизации исследуемого района варьировала от слабой, когда компактизация касалась только одного диска, до гетерохроматизации всего района (Рисунок 1).

Рис.1. Локализация белка SUUR на политенных хромосомах слюнных желез линии Dp(1;1)pn2b. А,Б – район дупликации без признаков гетерохроматизации; В,Г – компактизация района 2CD; Д,Е – компактизация района 2В; Ж,З – гетерохроматизация участка 1D-2C. Район компактизации отмечен скобкой. А, В,Д,Ж – фазовый контраст; Б,Г,Е,З – иммунолокализация белка SUUR – белый сигнал на черном фоне.

Полученные результаты показали, что SUUR появляется в районах, подверженных гетерохроматизации при ЭПМ, так как его присутствие совпадает с паттерном компактизации эухроматиновых районов.

Влияние мутации SuUR на степень политенизации последовательностей в районах, подверженных ЭПМ. Известно, что эухроматиновые районы политенных хромосом, подверженные ЭПМ, в ряде случаев становятся недореплицированными. Мы оценили степень влияния мутации SuUR на политенизацию в области гена white в In(1)wm4h и в области гена scute в In(1)sc8.

Последовательность w1-4 из гена white полностью политенизируется у личинок дикого типа Oregon-R. В инверсии In(1)ww4h степень её политенизации составляет менее 5% по сравнению с диким типом. У гомозиготных мутантов SuUR степень представленности фрагмента w1-4 в перестройке In(1)ww4h увеличивается до 69% (Рисунок 2,А).

Рис. 2. А. Саузерн гибридизация зонда w 1-4 с геномной ДНК линии Oregon-R и изогенных линий wm4h;ru,h,SuUR+ и wm4h;ru,h,SuUR-. Б. Саузерн гибридизация зондов T2, l'sc, sc(RAM) с геномной ДНК линий sc8;SuUR+ и sc8;SuUR-. Д – диплоидная ткань (нейробласты). СЖ – слюнные железы. Интенсивность сигналов исследуемых зондов соотнесена с таковой полностью политенизированного фрагмента rosy.

Мы также определили степень представленности последовательностей, лежащих на разном расстоянии от точки разрыва в инверсии In(1)sc8 в линиях sc8;SuUR+ и sc8;SuUR-. Самая ближайшая к точке разрыва последовательность sc(RAM) в слюнных железах (8 т.п.н. от точки разрыва) политенизируется всего на 17% (Рисунок 2, Б).

Фрагмент l’sc, гомологичный участку, лежащему в 28 т.п.н. от точки разрыва, политенизируется на 24%. Даже на расстоянии 50 т.п.н. от точки разрыва In(1)sc8 политенизация участка, соответствующего фрагменту Т2, составила всего 47%. При введении мутации SuUR в линию все три последовательности становятся полностью представленными. Таким образом, мутация SuUR приводит к полной супрессии недорепликации в In(1)sc8 (Рисунок 2, Б).

Можно полагать, что функции белка SUUR при ЭПМ связаны с его влиянием на процесс репликации в гетерохроматиновых районах. Кроме того, влияние гена SuUR на ЭПМ может быть обусловлено его взаимодействием с продуктами генов, кодирующих другие белки гетерохроматина.

Локализация SUUR и гетрохроматинового белка HP1 взаимозависима. Белок НР1 играет центральную роль в формировании гетерохроматина. В диких линиях он локализован в хромоцентре и немногочисленных сайтах в плечах хромосом (Рисунок 3, А). Белок SUUR в норме колокализуется с НР1 в хромоцентре и обнаруживается в многочисленных сайтах интеркалярного гетерохроматина (Рисунок 3, Б). Чтобы определить, зависит ли способность белка SUUR связываться с хромосомами от белка НР1, провели иммуноокрашивание препаратов политенных хромосом трансгетерозигот Su(var)20503/Su(var)20505 антителами к белку SUUR. У таких мутантов белок HP1 (продукт гена Su(var)205) не выявляется на хромосомах у личинок третьего возраста. Оказалось, что при этом полностью отсутствует и сигнал локализации белка SUUR (Рисунок 3, В).

Это говорит о зависимости связывания SUUR от HP1. При оверэкспрессии HP1, индуцированной тепловым шоком в линии hs-HP1, HP1 связывается с множеством районов (Рисунок 3, Г). При этом сигнал белка SUUR целиком исчезает с хромосом как из районов интеркалярного гетерохроматина, так и из хромоцентра (Рисунок 3, Д). Однако, при одновременной оверэкспрессии HP1 и SUUR тепловым шоком картина связывания SUUR с хромосомами восстанавливается (см. Таблицу 4).

Рис. 3. Локализация на политенных хромосомах линии дикого типа Oregon-R белков HP1(А) и SUUR(Б). Отсутствие белка SUUR на хромосомах у 0-мутантов НР1(B). Локализация белка НР1(Г) и отсутствие белка SUUR(Д) при оверэкспрессии НР1.

Чтобы определить, сказывается ли делокализация белка SUUR при оверэкспресии НР1 на его функции, мы проверили, происходит ли подавление недорепликации ДНК в интеркалярном гетерохроматине, что характерно для мутантов SuUR. Для этого выбрали фрагмент Abd-A3 из максимально недореплицированной части района 89Е (Рисунок 4,А) и обнаружили, что при овреэкспреcсии НР1 политенизация этого фрагмента повышается до 20%, что говорит о нарушении функции белка SUUR (Рисунок 4,Б).

Таким образом, нормальное количество белка НР1 необходимо для нормального функционирования и локализации белка SUUR.

Рис. 4. А. Профиль недорепликации района 89Е1-2 в дикой линии OregonR и у мутанта SuUR (Moshkin et al., 2001). Б. Саузерн гибридизация зонда AbdA3 с геномной ДНК линий y,w (контроль) и hs-HP1 после воздействия серийного теплового шока. Д – диплоидная ткань (нейробласты). СЖ – слюнные железы. Интенсивность сигналов исследуемых зондов соотнесена с таковой полностью политенизированного зонда rosy.

Отсутствие белка SUUR не влияет на распределение HP1, у мутантов SuUR картина локализации HP1 на хромосомах не отличается от нормальной. Однако, при оверэкспрессии SuUR, индуцированной тепловым шоком, когда резко возрастает число сигналов SUUR, множество сигналов локализации HP1 появляется в эухроматиновых плечах. В результате этого практически все районы связаны как с SUUR, так и с HP1. В возникающих эктопических сайтах SUUR и HP1 колокализуются (Рисунок 5). Аналогичная картина наблюдается при оверэкспрессии SUUR в системе GAL4>UAS после индукции Sgs3 драйвером.

Рис.5. Локализация белков SUUR (А) и НР1 (Б) при оверэкспрессии SuUR, индуцированной тепловым шоком.

Возникновение дополнительных сайтов локализации НР1 на хромосомах при оверэкспресии SuUR может быть связано с усилением экспрессии гена Su(var)205, кодирующего НР1. Чтобы проверить это предположение, мы провели Вестерн гибридизацию антител против НР1 с белковыми экстрактами слюнных желез и показали, что при оверэкспрессии SuUR количество НР1 не возрастает, то есть, наблюдается именно перераспределение белка НР1, а не дополнительная экспрессия.

Для того, чтобы выяснить, какая часть белка SUUR является определяющей для перераспределения HP1, мы изучили распределение НР1 при экспрессии разных фрагментов белка SUUR на фоне мутации SuUR. Два из них, SUUR1-599 и SUUR1-799, - N-концевые фрагменты длиной с 1-й по 599-ю и с 1-й по 799-ю аминокислоты белка SUUR соответственно. SUUR495-962 - С-концевой фрагмент белка SUUR длиной с 495-й по 962-ю аминокислоты (Kolesnikova et al,, 2005). Полученные результаты показали, что оверэкспрессия N-концевых фрагментов SUUR1-599 и SUUR1-799 перераспределяет HP1 так же, как оверэкспрессия целого белка SUUR. Оверэкспрессия C-концевого фрагмента, SUUR495-962 не приводит к перераспределению НР1, и он остаётся в своих обычных сайтах - хромоцентре, 4 хромосоме, теломерах и 31 районе.

Таким образом, оверэкспрессия SuUR приводит к перераспределению НР1 на политенных хромосомах. Наличие неизмененной N-концевой части белка SUUR необходимо для наблюдаемого изменения паттерна локализации НР1.

Оверэкспрессия SUUR не приводит к изменению паттерна локализации белка HP2. На данный момент известно большое количество патрнёров НР1, имеющих различные функции и принимающих участие как в процессах генной репрессии, так и в репликации и репарации ДНК, а также в пространственной организации ядра. (Li et al., 2002; Hediger, Gasser, 2006). Можно ожидать, что обнаруженное нами перераспределение НР1 при оверэкспрессии SUUR отражается на паттерне локализации других белков – партнеров НР1. Хорошо изученным партнером НР1 является НР2, выявленный в дигибридной дрожжевой системе (Schaffer et al., 2002) и являющийся модификатором ЭПМ. Мы исследовали локализацию этого белка при перераспределении НР1 в результате оверэкспрессии SuUR. Оказалось, что оверэкспрессия SuUR, приводя к перераспределению НР1 на политенных хромосомах, не влияет на поведение НР2, и этот белок сохряняет нормальную локализацию (см. Таблицу 4).

Таблица 4. Локализация белков гетерохроматина в политенных хромосомах в зависимости от генотипа и экспериментальных условий.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»