WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Болдырева

Лидия Валерьевна

Влияние гена SuUR на эффект положения

и локализацию белков гетерохроматина

в политенных хромосомах Drosophila melanogaster

Генетика 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ

КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Новосибирск 2007

Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогенетики Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Беляева Елена Сергеевна

Институт цитологии и генетики

СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Высоцкая Людмила Васильевна

Новосибирский государственный

университет, г. Новосибирск

доктор биологических наук,

Колесников Николай Николаевич

Институт цитологии и генетики

СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: кафедра генетики,

Томский государственный

университет, г. Томск

Защита состоится «____» ___________2007г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу : 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. e-mail: dissov@bionet.nsc.ru, т/ф (383)3331278.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «___» __________ 2007г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Доктор биологических наук А.Д.Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Проблема регуляции активности генов – одна из важнейших в современной биологии. В настоящее время в центре исследований этого направления стоит феномен глубокой инактивации генов (silencing, сайленсинг - молчание). Это состояние устанавливается в раннем онтогенезе и затем наследуется в многочисленных циклах деления клетки. Эпигенетическая репрессия генной активности осуществляется мультимерными белковыми комплексами. ДНК-специфичное связывание репрессоров транскрипции с промоторными областями генов инициирует сборку комплексов, модифицирующих гистоны. Определенные комбинации модификаций гистонов, в свою очередь, обеспечивают установление и поддержание репрессированного состояния (Craig, 2005; Hediger, Gasser, 2006; Richards, Elgin, 2002; Ringrose, Paro, 2004).

Общими свойствами молчащих районов являются репрессия транскрипции, плотная упаковка и поздняя репликация ДНК в S-фазе клеточного цикла (Schubeler et al., 2002, обзор Zhimulev, Belyaeva, 2003). В политенных хромосомах слюнных желез D. melanogaster к молчащим районам относится область хромоцентра, содержащая прицентромерный гетерохроматин, и многочисленные районы интеркалярного гетерохроматина, дискретно распределенные по плечам хромосом. Прицентромерный гетерохроматин состоит, в основном, из повторенной ДНК - он насыщен мобильными элементами и сателлитными повторами. Кроме того, он содержит гены, для правильной экспрессии которых необходимо гетерохроматиновое окружение (Yasuhara, Wakimoto, 2006). В районах интеркалярного гетерохроматина лежат кластеры уникальных генов, имеющие сходные профили репликации и транскрипции (Belyakin et al., 2005).

У Drosophila на данный момент хорошо описаны два белковых комплекса, обеспечивающих репрессию. Один из них включает в себя белок HP1 (Heterochromatin protein 1) и гистон-метилтрансферазу SU(VAR)3-9 (Schotta et al., 2002). Этот комплекс собирается в прицентромерном гетерохроматине, репрессированное состояние которого может распространяться на перемещённые к нему эухроматиновые гены при эффекте положения мозаичного типа (ЭПМ). Другой белковый комплекс, в сборке которого основная роль принадлежит белкам группы PC-G (Polycomb Group), осуществляет репрессию эухроматиновых генов. Несмотря на значительные различия этих комплексов, механизмы их действия объединяет ряд общих черт, главной из которых является метилирование гистонов. Состав и функции отдельных компонентов репрессирующих комплексов служат предметом интенсивного изучения.

Белок SUUR, продукт гена SuUR (Suppressor of Underreplication), является уникальным гетерохроматиновым компонентом, так как он присутствует в обоих типах районов – интеркалярном и прицентромерном гетерохроматине. Фенотип мутации SuUR - подавление недорепликации в гетерохроматиновых районах политенных хромосом – обусловлен тем, что все районы интеркалярного гетерохроматина и некоторые прицентромерные районы заканчивают репликацию существенно раньше, чем в норме. Механизмы влияния гена SuUR на репликацию ДНК пока неизвестны. Он может действовать на уровне упаковки хроматина, делая его менее доступным для репликативной машины, однако, возможно также влияние на саму систему репликации.

ЭПМ возникает вследствие распространения репрессированного состояния гетерохроматина на перемещенные к нему гены. Поэтому об участии того или иного фактора в репрессии гетерохроматина судят, прежде всего, по его влиянию на степень проявления эффекта положения. Так, гены, кодирующие структурные белки гетерохроматина – НР1 и SU(VAR)3-9, SU(VAR)3-7, являются сильнейшими модификаторами эффекта положения.

Цель и задачи исследования

Природа факторов, определяющих локализацию белка SUUR в гетерохроматиновых районах, до настоящего времени не ясна. Неизвестно также, как ген SuUR влияет на организацию гетерохроматиновых доменов и взаимодействует ли белок SUUR с другими структурными белками гетерохроматина, такими как PС и HP1.

Целью настоящей работы было получение ответов на эти вопросы, а именно:

  1. Выяснить, является ли ген SuUR модификатором эпигенетического сайленсинга, возникающего при мозаичном эффекте положения гена.
  2. Определить взаимоотношения SUUR с другими хорошо известными белками гетерохроматина.

Для выяснения этих вопросов необходимо было выполнить следующие конкретные исследования:

  1. Изучить влияние мутации гена SuUR, дополнительных доз гена SuUR и его оверэкспрессии на ЭПМ в ряде эу-гетерохроматиновых перестроек.
  2. Выяснить, обнаруживается ли белок SUUR в районах хромосом, подверженных ЭПМ.
  3. Изучить влияние гена SuUR на политенизацию ДНК в районах хромосом, подверженных эффекту положения.
  4. Проверить взаимозависимость локализации белков SUUR, HP1, SU(VAR)3-7, НР2 и PC на политенных хромосомах методом непрямой иммунофлуоресценции:

а) изучить влияние мутаций генов, кодирующих SUUR и HP1, на связь гетерохроматиновых белков с хромосомами.

б) проверить, как влияет оверэкспрессия этих генов на их локализацию в хромосомах.

Научная новизна

Впервые выявлена функция гена SuUR как супрессора мозаичной экспрессии и недорепликации генетического материала при эффекте положения. Впервые показано, что белок SUUR появляется в эухроматиновых участках политенных хромосом, гетерохроматизированных в результате эффекта положения. Открыта взаимозависимость хромосомной локализации белка SUUR с белком HP1 – важнейшим компонентом респрессированных гетерохроматиновых доменов. Показано, что изменение в локализации и количестве этих белков приводят к сложной цепи нарушений в распределении белковых компонентов гетерохроматина.

Практическая ценность

Обнаруженное в работе сложное взаимодействие между гетерохроматиновыми белками необходимо учитывать во всех исследованиях, где используются линии, мутантные по генам, кодирующим данные белки, и оверэкспрессия этих генов. В особенности, это важно для работы с модификаторами эффекта положения и интерпретации результатов при изучении репликации ДНК.

Апробация работы

Результаты работы представлены на международных конференциях в докладах и стендовых сообщениях: на 5-ой международной конференции по гетерохроматину (Кортона, Италия, 2001), XIV Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2002), III съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), 7-ой международной конференции по гетерохроматину (Губбио, Италия, 2005), 8-ой международной конференции по гетерохроматину (Губбио, Италия, 2007) и др.

Объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 217 ссылок. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 18 рисунков.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Вклад автора

Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа по выявлению домена SUUR, необходимого для перераспределения белка НР1, выполнена совместно с Т.Д. Колесниковой. Картирование сайтов локализации белка SUUR на политенных хромосомах линии дикого типа Oregon-R проведено И.Ф. Жимулевым. Саузерн гибридизация фрагментов из интеркалярного гетерохроматина района 89Е выполнялась совместно с С.А. Демаковым.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность д.б.н. Е. С. Беляевой, академику РАН И.Ф. Жимулеву, к.б.н. Д. Е. Корякову, к.б.н В.В. Шломе, к.б.н. Т.Д. Колесниковой, А.В. Пиндюрину за помощь в работе и обсуждение результатов. Автор также благодарен всем сотрудникам отдела молекулярной цитогенетики за постоянную поддержку.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии D. melanogaster описаны в справочнике (Lindsley, Zimm, 1992), базе данных FlyBase (http://www.flybase.org/), а также, в статьях (Belyaeva et al., 1998, Belyaeva et al., 2003, Makunin et al. 2002; Zhimulev et al. 2003, Kolesnikova et al., 2005).

Экстракцию красного глазного пигмента мух проводили по методу Ephrussi and Herold (1944) с некоторыми модификациями, описанными в статье (Belyaeva et al., 2003).

Подсчет доли щетинок yellow, scute и Stubble вели по методу, описанному в статье (Belyaeva et al., 2003).

Статистическую обработку результатов проводили по схеме однофакторного дисперсионного комплекса с использованием критерия Фишера для анализа альтернативных (качественных) признаков (Васильева, 1999).

Непрямое иимунофлуоресцентное окрашивание политенных хромосом проводили по методике описанной в статье (Belyaeva et al., 2003).

Антитела Для детекции белка SUUR и его фрагментов использовали антитела Е45 против центральной части белка SUUR (Makunin et al. 2002). Антитела С1А9 против белка НР1 (НР1а) и антитела против белка НР2 были любезно предоставлены С. Элгин (США), против белка РС В. Пирротой (Швейцария), против белка SU(VAR)3-7 П. Спирером (Швейцария). В качестве вторых антител использовали коньюгаты иммуноглобулина G: полученные в козле против антигена кролика c флюорохромом FITC и полученные в козле против антигена кролика c родамином (Sigma).

Вестерн-блот анализ проводили согласно стандартной методике (Sambrook, Fritsch, Maniatis, 2004). Белковые экстракты получали из слюнных желез 4-х часовых предкуколок.

Количественный Саузерн-блот анализ проводили по методу, описанному в статье (Belyaeva et al., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние гена SuUR на ЭПМ

Целью первой части работы было охарактеризовать ген SuUR как возможный модификатор ЭПМ. Исследовали влияние мутации SuUR на репрессию гена white+ в инверсии In(1)wm4h, гена yellow+ в дупликации Dp(1;f)1187, мутации Stubble в транслокации T(2;3)SbV и гена scute+ в инверсии In(1)sc8.

При введении мутации SuUR в линию, несущую In(1)wm4h, мы обнаружили супрессирующее действие мутации SuUR на ЭПМ гена white. Измерение величины оптической плотности (OD480) экстрактов пигмента глаз у мух изогенных линий wm4h;ru,h,SuUR+ и wm4h;ru,h,SuUR- подтвердило повышение количества пигмента глаз у мутантов SuUR-(Таблица 1).

Таблица 1. Влияние мутации гена SuUR на ЭПМ гена white+ в изогенных линиях wm4h;ru,h, SuUR+ и wm4h;ru,h,SuUR-

OD480

Генотип

wm4h;ru,h,SuUR +

0,092 ± 0,005

0,049 ± 0,005

wm4h;ru,h,SuUR -

0,138 ± 0,005

0,068 ± 0,006

р0,99 р0,95

Полученные данные позволяют заключить, что мутация SuUR является модификатором ЭПМ. Однако влияние мутации SuUR на ЭПМ в перестройке In(I)wm4h оказалось, хотя и достоверным, но слабо выраженным.

Для изучения влияния мутации гена SuUR на ЭПМ гена yellow+ в "минихромосоме" Dp(1;f)1187 получили потомков от скрещиваний самок y,f; SuUR- с самцами y;Dp(1;f)1187,y+;SuUR+ и контрольного скрещивания самок y,f; SuUR+ с самцами y;Dp(1;f)1187,y+;SuUR+. Полученные потомки были гетерозиготами по мутации SuUR, либо гомозиготами по нормальному аллелю гена SuUR и несли Dp(1;f)1187. Для определения степени модификации ЭПМ у гомозигот по мутации гена SuUR была синтезирована линия y,w;Dp(1;f)1187,y+;SuUR-. Подсчитывали долю желтых щетинок, расположенных по краю крыла (Таблица 2).

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»