WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Важно почеркнуть, что анализировалось серийныене срезы яичников каждого животного: один срез окрашивался гематоксилином и эозином, а соседние срезы обрабатывались на различные иммуногистохимические реакции. Приготовление препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, проводилось с целью определения добротности материала, для получения обзорного препарата и для последующего сравнительного сопоставления препаратов, полученных после иммуногистохимических реакций.

Для трансмиссионной электронной микроскопии приготовление материала проводили по стандартной методике Millonig (Гайер Г., 1974). Полученные наблюдения позволили лишь детализировать уже известные сведения по ультрамикроскопической организации клеток фолликулов и дополнительно оценить состояние овоцитов.

Метод непрямого иммуногистохимического анализа.

Этот метод использовали для выявления: а) белков пролиферации и апоптоза (р53, bcl-2, PCNA, Ki-67, каспаза-9), б) универсальных ростовых факторов (васкулярный эндотелиальный, инсулиноподобный и эпидермальный), в) группы ферментных систем матриксных металлопротеиназ (ММП-1,9) и их тканевых ингибиторов (ТИММП-1,2). Реакции проводились на серийных парафиновых срезах яичников половозрелых крыс. В работе применялись наборы реактивов фирмы ДАКО (2002) и Santa Cruz Biotechnology (2004). В качестве первичных антител использованы моноклональные кроличьи антитела (разведение 1:100). Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали LSAB+Detection System (ДАКО) согласно инструкции, пероксидазную активность выявляли с помощью 3,3 диаминобензидина (DAB), препараты докрашивали гематоксилином Майера и заключали в бальзам. Выявление -субъединиц G-белков, фосфолипазы-С, аденилилциклазы проводили при помощи реакции непрямого иммуномечения. Реакцию ставили на криосрезах, фиксированных в 96% ацетоне. В качестве первичных антител использовали специфические наборы антител фирмы Dupon в разведении 1:500 в фосфатном буфере PBS с рН= 7,2, содержащем 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Визуализацию первичных связанных антител проводили с помощью авидин-биотин-пероксидазного комплекса (фирмы Camon). Результаты иммуногистохимических реакций в случае цитоплазматической локализации продукта оценивали в баллах (от 1 до 6) методом полуколичественного анализа с учетом количества окрашенных клеток (n). Реакция считалась отрицательной при полном отсутствии или экспрессии антигена менее чем в 5%; n от 5 до 24% - 1-2 балла (слабая экспрессия); n от 25 до 75% - 3-4 балла (умеренная); n более 75% - 5-6 баллов (выраженная). В случае ядерной локализации продукта реакции подсчитывался процент окрашенных ядер на 100 клеток. Анализ материала и подсчет активности мечения проводили с помощью микроскопа «Lеika».

Кроме полуколичественной оценки интенсивности иммуногистохимических реакций был проведен сравнительный количественный анализ функциональной активности фолликулов и их регионов с использованием метода компьютерной морфоденситометрии.

Результаты исследования и их обсуждение.

Иммуногистохимическая характеристика развивающихся фолликулов.

Внутриклеточные белки (PCNA, Ki-67, Bcl-2, p-53, каспаза-9), участвующие в регуляции процессов пролиферации и апоптоза. Анализировалось время появления, распределение, количественная оценка исследуемых белков.

Белок PCNA. По данным наших наблюдений этот белок экспрессируют овоциты и гранулезные клетки фолликулов всех стадий развития. Однако, экспрессия наиболее яркая в первичных и вторичных фолликулах. В овоцитах и клетках гранулезной оболочки крупных и атрезирующихся фолликулов обнаружено слабое иммуномечение. При этом theca interna и стероидпродуцирующие клетки стромы также проявляют слабое иммуномечение.

Кроме полуколичественной оценки интенсивности иммуногистохимической реакции на белок PCNA был проведен сравнительный количественный анализ иммуномечения активности фолликулов и их регионов с использованием компьютерного метода морфоденситометрии (КМДМ).

Рис. 1.

Рис. 2

I – примордиальный фолликул, II – первичный фолликул,

III – вторичный фолликул IV – третичный фолликул

Впервые с помощью системного подхода была проанализирована морфофункциональная взаимосвязь в системе «овоцит-фолликулярная зона» путем сравнительного анализа иммуногистохимического маркера в структурах яичника. Интегральный показатель морфофункционального состояния овоцита (как единичной клетки), в котором краситель распределен диффузно и интегральный показатель фолликулярной зоны (совокупности клеток) оказались различными. Фолликулярная зона оценивалась как средняя оптическая плотность (OD) и в то же время считалось количество зон (n) и брался интегральный показатель средней OD на количество зон. Аналогичным способом был проанализирован интегральный показатель оптической плотности некоторых других исследованных белков.

Контролируя наши данные, оцененные визуально (полуколичественно), мы выборочно сопоставили их с результатами, полученными методом КМДМ и на примере с оценкой интенсивности мечения белка PCNA выявили близкое сходство результатов оценки этих двух методов.

Белок PCNA – белок клеточной пролиферации - дополнительный белок к репарационной полимеразе ДНК. Эта полимераза устраняет различные поломки молекулы ДНК при размножении и формировании клеток в эмбриональном развитии и в течение всей жизни. Содержание PCNA в ходе клеточного цикла увеличивается и остается высоким до границы фаз G2/М. Учитывая важнейшее значение белка PCNA в жизнедеятельности клеток понятна и целесообразна необходимость увеличения его экспрессии по мере высокой активации пролиферации и дифференцировки структур растущих фолликулов и желтых тел. Тем более, что эти процессы характеризуются не только высокой напряженностью, но и кратковременностью.

Белок Ki-67. Иммуногистохимическая метка на этот белок выявляется в цитоплазме овоцитов и фолликулярных клеток примордиальных и вступивших в рост первичных фолликулов. В развивающихся фолликулах отмечается активная экспрессия в овоците, клетках гранулезной оболочки и единичных клетках формирующейся теки. Наиболее яркое мечение отмечается в фолликулярных клетках зрелых фолликулов. Степень мечения стероидпродуцирующих клеток, лютеоцитов желтых тел, клеток покровного эпителия оказывается менее интенсивной. В овоцитах атретических фолликулов специфической метки на белок Ki-67 не обнаруживается.

Белок Ki-67 участвует в стимуляции процесса репликации ДНК. Экспрессия Ki-67 четко ассоциирована с клеточной пролиферацией. Тот факт, что белок Кi-67 присутствует во всех активных фазах клеточного цикла (G1,S,G2 и митоз), но отсутствует в покоящемся состоянии (G0), делает его определение весьма информативным для характеристики пролиферации в конкретной клеточной популяции - в овоцит-гранулезном комплексе яичника.

Белок bcl-2. При проведении иммуногистохимической реакции регистрируется экспрессия белка овоцитами и фолликулярными клетками. Интенсивность иммуномечения фолликулярных клеток прямо пропорциональна степени развития фолликулов. Наиболее яркая экспрессия в овоците и в гранулезной оболочке характерна для третичных фолликулов. В клетках theca interna реакция значительно слабее. Интенсивно маркируются лютеоциты желтых тел. Стероидпродуцирующая строма иммунопозитивна. Сравнительно высокая экспрессия белка в клетках покровного эпителия свидетельствует об его участии в функционировании структур яичника. В овоцитах атрезирующихся фолликулов экспрессия bcl-2 отсутствует. В клетках уже сформированного атретического тела отмечается высокий уровень экспрессии данного белка.

Белок bcl-2 ключевое белковое соединение - занимает центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза. Запуск процесса апоптоза происходит за счет высвобождения митохондриальных факторов, которыми являются цитохром С, а также апоптозиндуцирующий фактор (по-видимому, протеаза). Высвобождение этих факторов приводит к распаду комплекса Bcl-2/неакгивная каспаза-9, что вызывает активацию каспазы-9, индуцирующей финальные стадии апоптоза. Однако, белок всl-2, связывая белок «bax», может выступать и в роли ингибитора апоптоза.

В развитии и атрезии фолликулов, также как и в формировании и обратном развитии желтых тел, эта многогранная функция белка bcl-2 несомненно определяющая: контроль прогрессирующего фолликулярного развития, перехода в атрезию, формирование новой эндокринной структуры – атретического фолликула, развитие и дегенерация желтых тел.

Белок р53. Экспрессия этого белка в цитоплазме овоцитов примордиальных фолликулов в наших препаратах минимальна. В первичных фолликулах (с двуслойной гранулезной оболочкой) экспрессия несколько более выражена. Во вторичных фолликулах (без полости, с многослойной гранулезной оболочкой и формирующейся текой) интенсивность иммуномечения нарастает и цитоплазма овоцитов положительно маркируется. Затем маркирование цитоплазмы овоцитов, как и клеток гранулезной оболочки вторичных и третичных фолликулов, становится интенсивнее. Локусы стероидпродуцирующих клеток и покровный эпителий включают метку. Соединительнотканная строма инертна. В атретических фолликулах специфическая метка на белок р-53 в овоцитах не определяется.

Интенсивное маркирование цитоплазмы овоцитов и фолликулоцитов вторичных и третичных фолликулов на исследуемый белок может быть связано с определяющим участием этого белкового соединения на этапах большого роста фолликулов. Возможность репарации поврежденной ДНК в структурах растущих фолликулов предотвращает тем самым появление мутантных клеток, то есть сохраняется генетическая полноценность созревающих овоцитов в ходе сложного процесса овофолликулогенеза.

Каспаза-9. Иммуногистохимическая метка выявляется и в ядрах, и в цитоплазме овоцитов и клеток фолликулярного эпителия. В примордиальных фолликулах слабо маркируются ядра овоцитов и клетки фолликулярного эпителия. В первичных фолликулах с двуслойной гранулезной оболочкой, во вторичных и третичных фолликулах выраженно маркируется большинство ядер фолликулярных клеток. Клетки theca interna третичных фолликулов также активно включают метку. В стромальных элементах определяется положительная реакция в ядрах отдельных гладкомышечных клеток сосудов, эндотелии и в клетках покровного эпителия.

Свои особенности имеет распределение метки в популяции желтых тел. Выявляется метка в свежесформированных желтых телах. В лютеоцитах, лежащих на периферии желтых тел позитивны и ядра, и цитоплазма, а в лютеоцитах, лежащих ближе к центру – только ядра. Иначе выглядят старые генерации желтых тел: умеренно маркируется часть ядер соединительнотканных клеток, слабо окрашивается цитоплазма лютеоцитов, расположенных по периферии этой временной железы. Активно маркируются и ядра, и цитоплазма клеток атретических тел.

Цистеиновые протеазы – каспазы – являются основными фигурантами эффекторной фазы апоптоза. Каспаза-9 относится к группе индукторов, принимающих апоптотический сигнал и передающих его на эффекторные каспазы, которые будучи активированными, начинают цепь протеолитических событий, цель которых – демонтаж клетки. Участие каспаз в апоптозе направлено на разрыв связей с окружающими клетками, реорганизацию цитоскелета, снижение возможностей репарации и репликации ДНК, разрыв ядерной мембраны и разрушение ДНК, выброс сигналов, маркирующих клетку для апоптоза, расчленение клетки на апоптотические тельца. В яичнике, как ни в каком другом органе, процессы роста и обратного развития являются составляющими его жизнедеятельности, превалируя или уменьшаясь на разных этапах фолликулогенеза, лютеогенеза и атрезии. Поэтому каспаза-9 – обязательный и постоянно работающий фермент в структурах яичника.

Матриксные металлопротеиназы (ММП) и их тканевые ингибиторы (ТИММП). Экспрессия ММП-1 обнаруживается в половых клетках всех стадий развития фолликулов. Специфическое маркирование выявляется и в ядре, и в цитоплазме овоцитов. Иммунопозитивны и клетки гранулезной оболочки фолликулов разных стадий развития. Степень мечения гранулезных клеток прямо пропорциональна степени зрелости фолликулов: в примордиальном и начавшем рост первичном фолликуле гранулезные клетки слабо включают метку, в то время как наибольшее количество иммуногистохимических включений обнаруживается в клетках полостных вторичных и третичных фолликулах. Клетки theca interna маркируются умеренно, в то время как локусы интерстициальных гормопродуцирующих клеток и клетки покровного эпителия визуализируются четко. В сосудах определяется следовая реакция. Соединительнотканная строма яичника иммунонегативна. В лютеиновых клетках функционально активных желтых тел ММП-1 определяется, в стромальных компонентах – не выявляется.

Распределение ММП-9 в соматических и половых клетках фолликулов разных стадий развития, клетках желтых и атретических тел, интерстициальной ткани яичников и покровного эпителия практически идентично ММП-1.

Как показывают проводимые исследования, семейство ММП и ТИММП является мощной ферментной системой, способной активно перестраивать матрикс в процессе физиологического и патологического развития тканей. В яичнике происходит постоянный рост фолликулов и желтых тел, что требует непрерывной реорганизации в клеточном составе этих структур и реорганизации окружающего соединительнотканного матрикса. Этим объясняется иммуномечение этих ферментов не только в фолликулоцитах растущих фолликулов, но и в овоцитах. При участии коллагеназы ММП-1 происходит перестраивание фибриллярного коллагена (важного структурного компонента матрикса), а при участии желатиназы ММП-9 – перестройка коллагена четвертого типа (основного компонента базальных мембран). Благодаря этой перестройке создаются оптимальные условия для быстрорастущих фолликулов и желтых тел, образования атретических тел. В результате этого овоциты и фолликулоциты созревающих фолликулов получают возможность расти и дифференцироваться. Перестройка коллагена также способствует клеточной миграции: пролиферация фолликулярных клеток, разрастание и накопление клеток theca interna вокруг увеличивающихся в объеме фолликулов, врастание клеток тека при формировании атретических тел, прогрессивное увеличение лютеоцитов, врастание периферических лютеоцитов в формирующиеся желтые тела.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»