WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Для воспроизведения модели мукополисахаридоза у крыс был использован сурамин (любезно предоставлен проф. П. Д. Хартом, Великобритания). Сурамин вводили однократно внутрибрюшинно в виде раствора (50 мг/мл) на 0,9% NaCl в дозе 250 мг/кг массы. В этой дозе сурамин вызывает накопление ГАГ в лизосомах печени, снижает скорость внутрилизосомального протеолиза, не подавляя захват клетками печени белка и не нарушая целостности лизосом (Davies et al, 1969, 1971). Крысам контрольной группы вводили однократно внутрибрюшинно физиологический раствор.

Общее количество сульфатированных ГАГ, креатинин определяли у крыс в случайных порциях мочи, собранных на 2, 5, 14 сутки после введения препаратов. Проводилось также выделение ГАГ из мочи для последующего разделения ГАГ на отдельные виды методом электрофореза на ацетатцеллюлезных мембранах. У крыс после введения сурамина на 2 сут проводили исследование активности кислой фосфатазы, катепсина D и -галактозидазы в гомогенате печени, а также исследование срезов печени светооптически и электронномикроскопически с использованием электронного микроскопа JEM – 7A (Япония).

Основные биохимические методы, использованные в работе:

1. Количественное определение кислых сульфатированных ГАГ в моче (Gold, 1981) в модификации (Пауль, Русова, 1995).

2. Выделение ГАГ мочи и электрофорез ГАГ на ацетатцеллюлезных мембранах в 0,1 М барий ацетатном буфере (рН 4,8) (Pennock, 1976).

3. Обработка гликозаминогликанов хондроитиназами АС и АВС (Saito, 1967).

4. Определение активности лизосомных ферментов в лейкоцитах и плазме крови (-D-галактозидаза (КФ 3.2.1.23), -D-гексозаминидаза общая (КФ 3.2.1.52), -гексозаминидаза А (КФ 3.2.1.30), -глюкуронидаза (КФ 3.2.1.31), -глюкоцереброзидаза (КФ 3.2.1.45), -галактозидаза (КФ 3.2.1.22), -идуронидаза (КФ 3.2.1.76), -фукозидаза (КФ 3.2.1.51), -маннозидаза (КФ 3.2.1.24), определяли с помощью флюоресцентных субстратов, производных метилумбеллиферона (Sigma, ICN), для определения активности арилсульфатазы А и В (КФ 3.1.6.8) использовали в качестве субстрата производное нитрокатехола, согласно Wenger et al. (1991); активность хитотриозидазы оценивали по методу Guo et al.(1995); активность идуронатсульфатазы (КФ 3.1.6.13) согласно методу Voznyi et al. (2001), кислой фосфатазы по методике Barrett A.L. (1972). Инкубационная смесь для оценки активности фермента (60 - 200мкл) содержала 0,1-0,5 М ацетатный или цитратный буфер (pH 5,0); 0,5 –10 мМ раствор субстрата. В каждую реакционную смесь добавляли взвесь лейкоцитов или плазму как источник фермента (4 – 120мкг) и инкубировали при 37°С в течение 15 – 120 мин. Реакцию останавливали добавлением 2 мл 0,085М глицин – натриевого буфера, рН 10,5. Об активности ферментов судили по количеству освобожденного метилумбеллиферона, измеряемого на флюориметре «Квант – 9» (Россия) при возбуждения 365 нм и эмиссии 448 нм. Активность фермента выражали в нмолях образовавшегося 4-метилумбеллиферона в расчете на 1 мг белка в 1 ч. В контрольных опытах инкубировали только субстрат и буфер и добавляли фермент после остановки реакции.

5. Определение белка в суспензии лейкоцитов проводили по методу Бредфорда как описано Шоно и соавт. (1988).

6. Креатинин в моче определяли по цветной реакции Яффе с помощью набора «Креатинин-ново» («Вектор-Бест», Россия)

7. Определение уровня глюкозы в крови проводили глюкозоксидазным методом с помощью набора «Новоглюк-м» («Вектор-Бест», Россия); клубочковая фильтрация и канальцевая реабсорбция определялась по клиренсу эндогенного креатинина, протеинурия определялась стандартным методом с сульфосалициловой кислотой (трехкратно) (Меньшиков, 2002). У больных сахарным диабетом без явной протеинурии оценивали альбуминурию иммунохимическим полуколичественным методом с помощью тест-полосок «Микраль-Тест-II» фирмы Boehringer «Mannheim» (Австрия).

Статистическую обработку результатов проводили методом параллельных рядов вариационной статистики с вычислением среднего арифметического (М) и ошибки среднего арифметического (m). Достоверность различий экспериментальных данных рассчитывали с использованием t - критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05. Вероятность различий составляла 95 % (Гланц, 1999). Обработку результатов производили с использованием пакета компьютерных прикладных программ Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

  1. Экскреция сульфатированных гликозаминогликанов с мочой, прошедших биохимический селективный скрининг наследственных болезней обмена.

Определение концентрации общих сульфатированных ГАГ в моче у 1523 человек, прошедших биохимический селективный скрининг наследственных болезней обмена (1996-1998 г.г.) выявило повышенную экскрецию ГАГ с мочой у 918 человек, что составило 60,3 % от числа обследованных пациентов. Частота встречаемости пациентов с повышенным содержанием сульфатированных ГАГ в моче в зависимости от возраста представлена в таблице 1.

Экскреция сульфатированных ГАГ мочи пациентов во всех возрастных группах значительно превышала содержание сульфатированных ГАГ в моче в контрольной группе (таблица 2).

Таблица 1.

Частота встречаемости гиперэкскреции сульфатированных

гликозаминогликанов у пациентов, прошедших биохимический

селективный скрининг наследственных болезней обмена

Возраст

Общее количество пациентов

Гиперэкскреция ГАГ мочи

Количество пациентов (абсолютное)

%

(относительное)

До 1 года

111

52

46,8 %

1-3 год

219

125

57,1 %

4-7 лет

288

150

52,1 %

8-12 лет

290

187

64,5 %

13-16 лет

193

147

76,2 %

17-21 год

105

76

72,3 %

22-60 лет

316

181

57,3 %

Таблица 2

Концентрация гликозаминогликанов в моче пациентов

по возрастным группам (мг ГАГ/ ммоль креатинина)

Возраст

Контрольная группа

(M ± m)

Группа с повышенной экскрецией ГАГ

(M ± m)

До 1 года

12,8 ± 3,7 (n=6)

25,4 ± 2,3* (n=52)

1-3 года

8,2 ± 0,5 (n=17)

14,0 ± 0,9* (n=125)

4-7 лет

5,8 ± 0,4 (n=17)

9,9 ± 0,7* (n=150)

8-12 лет

4,1 ± 0,3 (n=14)

7,2 ± 0,4* (n=187)

13-16 лет

2,7 ± 0,7 (n=17)

6,4 ± 0,5* (n=147)

17-21 года

2,7 ± 0,1 (n=17)

4,1 ± 0,3* (n=76)

22-60 лет

3,4 ± 0,2 (n=68)

5,5 ± 0,3* (n=181)

Примечание - * р < 0,001, достоверность различий по сравнению с контролем; n – количество обследованных.

Среди пациентов с повышенной экскрецией сульфатированных ГАГ выделена группа пациентов с лизосомными болезнями накоплениями – 8 человек с мукополисахаридозами и 4 человека с болезнью Гоше, и группа пациентов с сахарным диабетом, часто встречающимся нарушением углеводного обмена - 73 человека.

  1. Экскреция сульфатированных гликозаминогликанов с мочой у пациентов с лизосомными болезнями накопления

Лизосомные болезни накопления являются результатом мутаций в генах, отвечающих за синтез лизосомных ферментов (Видершайн, 1980; Краснопольская, 2005; Neufeld et al., 1970.,1975; McKusick, 2006). В случае мукополисахаридозов снижена или отсутствует активность лизосомных ферментов, отвечающих за деградацию гликозаминогликанов. Развитие болезни Гоше связано с мутациями в гене -глюкоцереброзидазы и снижением ее активности в лизосомах всех клеток в организме больных. Лабораторные исследования для диагностики лизосомных болезней накопления включили в себя: анализ количества и качественного состава сульфатированных ГАГ мочи (таблица 3, рисунок 1) и определение активности лизосомных ферментов в лейкоцитах и плазме крови (таблица 4). Диагноз мукополисахаридоза был установлен 8 пациентам. Обнаружено отсутствие активности идуронат-сульфатазы в лейкоцитах периферической крови у 4 пациентов, что позволило верифицировать МПС II типа. Активность арилсульфатазы В в лейкоцитах периферической крови отсутствовала у 1 пациента, что характерно для МПС VI. Содержание сульфатированных ГАГ в моче у отдельных больных МПС превышало средний уровень показателей в возрастной группы в 3 - 10 раз (рисунок 2). Качественный состав ГАГ также изменялся: в моче методом электрофореза обнаружен дерматансульфат в значительном количестве; усилилось выделение хондроитинсульфата и гепарансульфата.

Диагноз болезнь Гоше выставлен 4 пациентам на основании клинических данных, снижения активности -глюкоцереброзидазы лейкоцитов, повышении активности хитотриозидазы и кислой фосфатазы в плазме крови. Количество ГАГ в моче у этих пациентов было увеличено в 3 случаях, но не более чем в 2 раза (рисунок 2).

Рисунок 1. Электрофорез ГАГ мочи больных мукополисахаридозами.

Линии 1, 2, 3, 4, 5: ГАГ, выделенные из мочи больных мукополисахаридозами.

Линия 6: Стандарты: ХС – хондроитинсульфат; ГС – гепарансульфат.

Таблица 3

Содержание и качественный состав сульфатированных гликозаминогликанов мочи у пациентов с мукополисахаридозами

№ пациента п/п

Возраст, в котором установлен диагноз

Возрастная норма содержания ГАГ в моче (мг ГАГ / ммоль креатинина)

Количественное содержание ГАГ в моче (мг ГАГ / ммоль креатинина)

Качественный состав ГАГ мочи

№ 1

2 г 8 мес

8,2 ± 0,5

39,9

ГС++; ДС+++

ХС+++

№ 2

2 г 1 мес

8,2 ± 0,5

38,6

ГС++++; ДС++++

ХС++++

№ 3

25 лет

3,4 ± 0,2

5,4

ГС+; ДС++

ХС+

№ 4

8 лет 11мес

4,1 ± 0,3

36,0

ГС+; ДС+++

ХС+

№ 5

3 г 5 мес

5,8 ± 0,4

19,5

ГС++; ДС++++

ХС+++

№ 6

17 лет

2,7 ± 0,1

26,2

ГС++; ДС+++++

ХС++++

№ 7

4 г 10 мес

5,8 ± 0,4

13,1

ГС++; ДС+++

ХС+++

№8

6 лет 11 мес

5,8 ± 0,4

34,7

ГС++; ДС+++++

ХС++++

Обозначения: ГАГ - гликозаминогликаны; ГС - гепарансульфат; ДС -дерматансульфат; ХС - хондроитнсульфат.

+ -признак присутствует: + ; ++ ; +++ -степень выраженности признака

Таблица 4

Активность лизосомных ферментов в лейкоцитах крови

у больных мукополисахаридозами и болезнью Гоше (в % от контроля)

Название фермента

Пациенты

1 МПС II

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»