WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Ген

Нуклеотидная замена

Аминокислотная замена

Локализация

в гене

NAT1

C97T

Arg33Stop

ORF

C190T

Arg64Trp

ORF

G350,351C

Arg117Thr

ORF

T402C

-

ORF

A752T

Asp251Val

ORF

1025

-

3'-UTR

NAT2

T111C

-

ORF

C190T

Arg64Trp

ORF

G191A

Arg64Gln

ORF

C282T

-

ORF

A434C

Gln145Pro

ORF

C481Т

-

ORF

G590A

Arg197Gln

ORF

C759T

-

ORF

A803G

Lys268Arg

ORF

G857A

Gly286Glu

ORF

T859C

Ser287Pro

ORF

859Del

Ser287Frameshift

ORF

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимизация набора эндонуклеаз рестрикции для выявления полиморфных вариантов генов NAT

Полиморфизм 1025 гена NAT1 обнаружен Lo-Guidice J-M. et al. (2000). К настоящему времени не было разработано способа его обнаружения методом ПДРФ-анализа. Нами предложено использовать эндонуклеазу Sse9I для обнаружения полиморфизма 1025, при наличии которого наблюдается исчезновение сайта узнавания (рис. 1). Более предпочтительно обнаружение полиморфизма по появлению нового сайта узнавания при его наличии, но в данном случае анализ сайтов узнавания известных эндонуклеаз рестрикции показал отсутствие такой возможности.

Рис. 1. Обнаружение полиморфизма 1025 гена NAT1 методом ПДРФ-анализа. (а) Положение сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции Sse9I (выделен сайт узнавания ААТТ). Звездочкой обозначено положение полиморфизма. (б) Электрофореграмма гидролиза эндонуклеазой Sse9I. Дорожки 1-12 – «дикая» гомозигота; М – маркер точных длин фрагментов ДНК.

Полиморфизм А752T гена NAT1 был открыт Lin H.J. et al. (1998), для обнаружения которого методом ПДРФ-анализа этими авторами предложено использовать эндонуклеазу рестрикции BglII. Для BglII в последовательности аллеля «дикого» типа гена NAT1 имеется единственный сайт узнавания, который затрагивает нуклеотиды 750-755. Нами предложено для обнаружения А752Т использовать эндонуклеазу Bst4CI, что дает возможность определенно локализовать полиморфизм по появлению нового сайта узнавания в аллеле 752T (рис. 2). Дополнительным преимуществом использования эндонуклеазы рестрикции Bst4СI является наличие в последовательности гена NAT1 двух константных сайтов узнавания, что позволяет контролировать полноту протекания гидролиза.

Рис. 2. Обнаружение полиморфизма A752T (Asp251Val) гена NAT1 методом ПДРФ-анализа. Выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BglII и Bst4CI. Звездочкой обозначено положение 752.

В исследованной нами выборке обнаружен один гетерозиготный носитель полиморфизма А752T. При этом результаты ПДРФ-анализа для эндонуклеазы рестрикции BglII совпадают с таковыми для Bst4CI (рис. 3).

Рис. 3. Электрофореграмма гидролиза эндонуклеазами рестрикции BglII (а) и Bst4CI (б). Дорожка 5 – генотип 752АT; М – маркер точных длин фрагментов ДНК.

Для обнаружения полиморфизма G191A (Arg64Gln) гена NAT2 методом ПДРФ-анализа было предложено использовать эндонуклеазу MspI (Bell et al., 1993). Для MspI в интересующем районе сайт узнавания имеется в аллеле «дикого» типа и затрагивает нуклеотиды 189-192 (рис. 4).

Рис. 4. Обнаружение полиморфизмов С190Т и G191A гена NAT2 методом ПДРФ-анализа. Выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции MspI, Bse1I и Bst2UI. Звездочками обозначены положения полиморфизмов.

После того, как был открыт полиморфизм C190T (Arg64Trp) гена NAT2 (Shishikura et al., 2000) стало понятно, что при выявлении полиморфизма G191A эндонуклеазой MspI часть образцов может содержать полиморфизм C190T. До настоящего времени не был разработан способ различать эти два полиморфизма методом ПДРФ-анализа. Нами предложено проводить гидролиз исходных амплифицированных образцов с выявленным MspI-полиморфизмом последовательно эндонуклеазами Bse1I и Bst2UI. Для эндонуклеазы Bse1I появляется новый сайт узнавания в аллеле 190Т, что свидетельствует о наличии полиморфизма C190T и об отсутствии полиморфизма G191A. Если электрофоретическая картина гидролиза эндонуклеазой Bse1I свидетельствует об отсутствии C190T, следующий этап заключается в гидролизе исходных амплифицированных образцов эндонуклеазой Bst2UI, для которой появляется новый сайт узнавания в аллеле 191A (рис. 4).

Рис. 5. Электрофореграмма гидролиза эндонуклеазой рестрикции MspI. Дорожки 1-10 – «дикая» гомозигота; М – маркер точных длин фрагментов ДНК.

В исследованной нами выборке не обнаружено индивидуумов с MspI-полиморфизмом, что свидетельствует об отсутствии полиморфных вариантов С190Т и G191A (рис. 5), однако при исследовании популяций с высокой частотой встречаемости MspI-полиморфизма, например афро-американской, предложенный нами комплексный подход может иметь большое прикладное значение.

В гене NAT2 одним из первых был открыт полиморфизм G857A (Gly286Glu) (Ohsako, Deguchi, 1990), для обнаружения которого методом ПДРФ-анализа было предложено использовать эндонуклеазу BamHI (Hickman, Sim, 1991). Для BamHI в последовательности аллеля «дикого» типа гена NAT2 имеется единственный сайт узнавания, который затрагивает нуклеотиды 856-861 (рис. 6). Недавно были открыты полиморфизмы T859C (Ser287Pro) и 859Del, который приводит к сдвигу рамки считывания (Anitha, Banerjee; 2003). Соответственно, выявленный по предложенному методу (Hickman, Sim, 1991) аллель 857A на самом деле может оказаться 859C или 859Del. Способ, позволяющий различать эти полиморфизмы с помощью ПДРФ-анализа, до настоящего времени не был разработан. Нами предложено проводить гидролиз исходных амплифицированных образцов с выявленным BamHI-полиморфизмом последовательно эндонукеазами HinfI и AspS9I. Для эндонуклеазы HinfI появляется новый сайт узнавания в аллеле 857A, что свидетельствует о наличии полиморфизма G857A и об отсутствии полиморфизмов T859C и 859Del. Дополнительным преимуществом использования эндонуклеазы HinfI, по сравнению с BamHI, является наличие константных сайтов в последовательности гена, что позволяет контролировать полноту протекания ферментативного гидролиза. Если электрофоретическая картина гидролиза эндонуклеазой HinfI свидетельствует об отсутствии G857A, следующий этап будет заключаться в гидролизе эндонуклеазой AspS9I, для которой появляется новый сайт узнавания при наличии полиморфизмов T859C или 859Del, при этом различить эти два полиморфизма не представляется возможным.

Рис. 6. Обнаружение полиморфизмов G857A, T859C и 859Del гена NAT2 методом ПДРФ-анализа. Выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI, HinfI и AspS9I. Звездочками обозначены положения полиморфизмов.

При проведения рестрикционного анализа в нашей выборке образцы с выявленным BamHI-полиморфизмом подвергались гидролизу HinfI. Для всех образцов с BamHI-полиморфизмом при гидролизе HinfI наблюдалось появление нового сайта узнавания, что свидетельствует о наличии полиморфизма G857A во всех образцах и отсутствии полиморфизмов T859C и 859Del в исследованной нами выборке. Типичные электрофореграммы гидролиза представлены на рисунке 7.

Рис. 7. Электрофореграмма гидролиза эндонуклеазами рестрикции BamHI (а) и HinfI (б). М – маркер точных длин фрагментов ДНК. (а) 2, 3, 4,5 – «дикий» генотип; 1 – генотип 857AG. (б) 4, 7, 8, 9 – «дикий» генотип; 1, 2, 3, 5, 6 – генотип 857AG.

Обобщенная характеристика длин фрагментов, образующихся в ходе ферментативного гидролиза по оригинальным методикам ПДРФ-анализа, представлена в таблице 2.

Таблица 2

Оригинальные методики обнаружения полиморфных вариантов

генов NAT ПДРФ-анализом

Ген

Замена

Эндо-нуклеаза

Длина образующихся фрагментов

«Дикий» аллель

Полиморфный аллель

NAT1

A752T

Bst4CI

879, 194, 479

879, 194, 53, 426

1025

Sse9I

226, 27, 51, 99, 26, 358, 110, 73, 139, 289, 103, 46, 5

226, 27, 51, 99, 26, 358, 110, 73, 139, 392, 46, 5

NAT2

C190T

Bse1I

227, 62, 18, 693

188, 39, 62, 18, 693

G191A

Bst2UI

204, 273, 367, 156

186, 18, 273, 367, 156

G857A

HinfI

467, 137, 396

467, 137, 249, 147

Поиск новых полиморфизмов в гене NAT2

Несмотря на то, что генетический полиморфизм NAT2 давно известен (Grant et al., 1990), до настоящего времени продолжается активный поиск новых полиморфных вариантов этого гена. В результате проведенных работ к 1995 г. было открыто 9 полиморфизмов в гене NAT2 (Vatsis et al., 1995), к 2000 г. – 13 полиморфизмов (Hein et al., 2000), а в 2003 г. было обнаружено еще 4 полиморфизма (http://louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html). Такая динамика открытия новых полиморфных вариантов гена NAT2 наталкивает на мысль о существовании еще неописанных полиморфизмов. Поскольку ПДРФ-анализ позволяет не только выявлять известные полиморфизмы, но также дает возможность поиска новых, нами был проведен такой поиск. Для формирования набора эндонуклеаз рестрикции предварительно были определены положения сайтов узнавания для различных эндонуклеаз в первичной последовательности гена NAT2 (GenВank, Acc. Number X14672) с использованием программы Dnasis. Из этого списка была отобрана группа эндонуклеаз рестрикции, для которых уже имеются сайты узнавания и возможно появление новых сайтов в нуклеотидной последовательности гена NAT2: AccB1I, AluI, AspS9I, Bme18I, BstACI, Bst4CI, BstDSI, ErhI, Fsp4HI, HinfI, RsaI, SfaNI, SmiMI. Для отобранной группы эндонуклеаз рестрикции был проведен анализ появления новых сайтов узнавания при наличии возможных полиморфизмов в участках последовательности, частично совпадающих с сайтами узнавания этих эндонуклеаз.

В результате, при частичном перекрывании имеющихся и появляющихся при возможных полиморфизмах сайтов узнавания, данным набором эндонуклеаз тестировали в сумме 254 нуклеотида (29.7% транслируемой последовательности гена). Среди этих нуклеотидов выявление замены на любой из трех других нуклеотидов (например, замена Т на А, G или C) было возможно в 50 положениях нуклеотидной последовательности гена (6.2%); на два из трех – в 37 положениях (4.3%); только на определенный нуклеотид – в 167 положениях (19.2%). В качестве иллюстрации выявления любой замены приведем тимин в положении 709. В этой области первичная последовательность частично совпадает с сайтами узнавания для нескольких эндонуклеаз (табл. 3). Во втором варианте выявление замены в двух из трех возможных нуклеотидов достигалось в 37 положениях. Например, на участке последовательности 5-87GCACCAGA в положении 90 у «дикого» типа находится цитозин, в случае мутации C90T появляется новый сайт узнавания для эндонуклеазы SfaNI (5-87GCATC); при мутации С90G - для эндонуклеазы Fsp4HI (5-87GCAGC); выявление мутации C90A используемым набором эндонуклеаз невозможно.

Таблица 3

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»