WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Анализ взаимодействия ЛП со стероидными гормонами показал, что наибольшее снижение флуоресценции было для частиц ЛПВП (55-65%). Менее выраженным данный эффект был для ЛПОНП (30-35%) и для ЛПНП (15-20%). При этом форма спектров, их полуширина практически не изменялись.

В частицах ЛПВП основным структурно-функциональным белком является апоА-I. В связи с этим, изучали связывание стероидов хроматографически очищенным апоА-I. На рис. 1. приведены кривые тушения триптофановой флуоресценции апоА-I при образовании комплексов с тетрагидрокортизолом. Тушение составило 29%. На рис. 2. приведены кривые тушения триптофановой флуоресценции апоА-I при образовании комплексов с прегненолоном. Тушение составило 20%.

Изучение временной зависимости тушения флуоресценции при одномоментном добавлении насыщающих количеств стероидов показало, что полное насыщение связывающих областей ЛП-частиц гормонами происходит уже через 30 мин от начала опыта.

Рис. 1. Спектры триптофановой флуоресценции апоА-I при комплексообразовании с тетрагидрокортизолом.

( ) – апоА-I (исходный спектр);

( ) – апоА-I + тетрагидрокортизол (через 60 мин);

Рис. 2. Спектры триптофановой флуоресценции апоА-I при комплексообразовании с прегненолоном.

( ) – апоА-I (исходный спектр);

( ) – апоА-I + прегненолон (через 60 мин).

В таблице 1. представлены константы связывания различных стероидов с ЛП фракциями и изолированного апоА-I, полученные на основе кривых тушения триптофановой флуоресценции. Константы ассоциации комплексов белок-лиганд (106 М-1) свидетельствуют о достаточно высоком сродстве, поэтому связывание можно назвать специфическим.

Таблица 1.

Константы ассоциации для комплексов липопротеин-стероид на основании кривых тушения флуоресценции триптофана.

Стероид

ЛПОНП

ЛПНП

ЛПВП

АпоА-I

Кортикостерон

0,6х106М-1

0,67х106М-1

3,6х106М-1

0,8х106М-1

Дезокси-

кортикостерон

1,02х106М-1

0,14х106М-1

4,0х106М-1

0,3х106М-1

Тестостерон

1,2х106М-1

0,27х106М-1

4,8х106М-1

0,7х106М-1

Прогестерон

0,6х106М-1

0,64х106М-1

4,4х106М-1

0,5х106М-1

Для изучения комплексообразования апоА-I c прегненолоном мы исполоьзовали также метод гель-фильтрации. Хроматографию проводили на сефадексе G-25. На колонку одновременно нанесли хроматографически чистый апоА-I и 14С-прегненолон, при этом белок выходил отдельным пиком без регистрации радиоактивности. Затем инкубация апоА-I с 14С-прегненолоном на выходе показала присутствие метки во фракции белка. Что подтверждает данные по тушению триптофановой флуоресценции о процессе комплексообразования апоА-I-гормон. Присутствие 1000-кратного избытка немеченого прегненолона практически вытесняло меченый, что также позволяет говорить о специфичности связывания гормон-белок.

Для выяснения закономерностей в регуляции экспрессии генов, связанных с усилением биосинтеза белка, были проведены исследования в двух независимых парах стероидных гормонов. Первая пара представляет гормоны пучковой зоны коры надпочечников. Это кортизол и его восстановленная форма – тетрагидрокортизол. Разница между ними заключается в том, что у последнего гормона 4–3-кетогруппа А-кольца восстановлена. Гидроксил в 3-м положении ТГК находится в транс-позиции. Вторая пара гормонов – прогестерон и прегненолон. По структуре А-кольца первый гормон полностью соответствует кортизолу, а второй - тетрагидрокортизолу, только оксигруппа в 3-м положении у прегненолона находится в цис-позиции.

Проведены нами исследования показали, что в паре кортизол – тетрагидрокортизол только комплекс апоА-I-ТГК значительно усиливал скорость биосинтеза белка в гепатоцитах по сравнению с контролем (табл. 2). Кортизол, комплекс апоА-I-кортизол и ТГК не вызывали достоверных изменений по сравнению с контролем.

Таблица 2.

Изменение скорости биосинтеза белка в гепатоцитах крыс (M±m)

Условия инкубации

Скорость биосинтеза белка, имп/мин на 1 мг белка, (n=5)

Контроль

18016 ± 554

АпоА-I

15763 ± 452 #

Кортизол

16395 ± 398 #

ТГК

15559 ± 433 #

АпоА-I - кортизол

15854 ± 317 #

АпоА-I - ТГК

32802 ± 1175 *

* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,001)

# - достоверное различие по сравнению с комплексом апоА-I-ТГК (р < 0,05)

Результаты в паре прогестерон – прегненолон оказались схожими, биологической активностью обладал комплекс апоА-I-прегненолон, который имеет восстановленную окси группу в А кольце, он значительно усиливал биосинтез белка, тогда как комплекс апоА-I-прогестерон не изменял скорость включения 14С-лейцина по сравнению с контролем (табл. 3).

Таблица 3.

Изменение скорости биосинтеза белка в гепатоцитах крыс (M±m)

Условия инкубации

Скорость биосинтеза белка, имп/мин на 1 мг белка, (n=6)

Контроль

57606 ± 2762

АпоА-I

50405 ± 1446 #

Прогестерон

64815 ± 968 #

Прегненолон

57730 ± 1267 #

АпоА-I - прогестерон

64055 ± 1415 #

АпоА-I - прегненолон

112089 ± 1560 *

* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,001)

# - достоверное различие по сравнению с комплексом

апоА-I– прегненолон (р < 0,001)

Сами прогестерон и прегненолон также не вызывали достоверных изменений по сравнению с контролем.

Проведенные исследования говорят о том, что в комплексе с апоА-I биологической активностью обладает не только восстановленная форма кортизола - тетрагидрокортизол, но и соответствующий ему по структуре А-кольца прегненолон. Считаем, что в повышении скорости биосинтеза белка в гепатоцитах принципиально важную роль играет восстановленная 4–3-кетогруппа стероидных гормонов.

Ранее уже было показано, что комплекс апоА-I с тетрагидрокортизолм обладает биологической активностью, которая заключается в усилении экспрессии генов и увеличении скорости биосинтеза ДНК, РНК и белка. Исходя из литературных данных о регуляторных эффектах апоЕ, мы предположили, что этот белок может играть роль отрицательной обратной связи в данном механизме усиления биосинтеза белка и нуклеиновых кислот. Проведенные нами исследования показали, что апоЕ полностью подавлял повышение биосинтеза ДНК, РНК и белка, вызванное действием комплекса апоА-I– ТГК (табл. 4).

Таблица 4.

Изменение скорости биосинтеза ДНК, РНК и белка в гепатоцитах

(M±m)

Условия икубации

Скорость биосинтеза имп/мин на мг белка (n=6)

ДНК

РНК

Белка

Контроль

1343 ± 74

1155 ± 52

18016 ± 554

АпоА-I - ТГК

1985± 104 *

2275 ± 173 *

32802 ± 1175 *

АпоЕ

862 ± 70 *#

1134 ± 131 #

19942 ± 2463 #

АпоА-I - ТГК + апоЕ

803 ± 48 *#

1132 ± 191 #

21823 ± 2292 #

* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,01)

# - достоверное различие по сравнению с комплексом

апоА-I – ТГК (р < 0,01)

В отсутствии комплекса апоА-I-ТГК в среде инкубации апоЕ не оказывал влияния на биосинтез белка и РНК, но снижал скорость включения меченого тимидина в ДНК в 1,6 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, между комплексом апоА-I–ТГК и апоЕ существуют конкурентные взаимоотношения. Они проявляются в том, что комплекс апоА-I–ТГК усиливает синтез ДНК, РНК и белка в гепатоцитах, в то время как апоЕ полностью снимает эффект комплекса.

В НИИ биохимии СО РАМН было показано, что клетки Купфера фагоцитируя продукты клеточной деградации, кооперативно с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза захватывают ЛПВП3 и стероидные гормоны. ЛПВП3 во вторичных лизосомах подвергаются дезинтеграции с образованием апоА-I, а стероидные гормоны восстанавливаются при участии - и -редуктаз с образованием тетрагидросоединений. Полученные продукты образуют биологически активный комплекс, который сначала попадает в интерстициальное пространство, а затем в ядра гепатоцитов, где и усиливает экспрессию генов.

Мы изучали этот процесс на культуре клеток асцитной гепатомы Эрлиха. Полученные данные показали, что добавление ЛПВП и кортизола увеличивала скорость биосинтеза белка в сокультуре клеток асцитной гепатомы и опухолевых макрофагов (табл.5). Добавление ЛПВП и кортизола в культуру без прилипающих клеток не вызывало достоверных изменений по сравнению с контролем. Что подтверждает данные, полученные ранее на нормальных клетках Купфера (Усынин И.Ф. 1996). У нас была задача изучить роль апоЕ в данном механизме, предположительно, он должен играть роль отрицательной обратной связи, снимая биологический эффект комплекса апоА-I-тетрагидрокортизол образованного в макрофагах. Полученные данные показали – апоЕ действительно ингибировал эффект комплекса апоА-I-ТГК (табл. 5).

Таблица 5.

Изменение скорости биосинтеза белка в клетках асцитной гепатомы Эрлиха (M±m)

Условия инкубации

Скорость биосинтеза белка, имп/мин х 103 на 1 мг белка, (n=6)

1. Контроль (сокультура)

816 ± 14,3

2. Сокультура + ЛПВП + кортизол

937 ± 35,4 *

3. Сокультура + апоЕ + ЛПВП + кортизол

733 ± 28,3* #

4. Клетки асцитной гепатомы + ЛПВП + кортизол

728 ± 20,5 * #

* - достоверное различие по сравнению с группой 1 (р < 0,05)

# - достоверное различие по сравнению с группой 2 (р < 0,05)

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»