WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |
The pathophysiology of diseases: from bench to bedside, Verona, Italy, 2003; 8th Congress of the European Hematology Association, Lyon, France, 2003; Российско-Норвежская конференция по вопросам гематологии, Санкт-Петербург, 2003; III Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004; 8-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2004; 9th Congress of the European Hematology Association, Geneva, Switzerland, 2004; 15th European Students' Conference for future doctors and young scientists, Berlin, Germany, 2004; XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 2005; Региональная конференция молодых ученых-окологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 2006; 13th International Student Congress of Medical Sciences, Groningen, the Netherlands, 2006; Совместная российско-американская конференция по проблемам гематологии и трансплантации костного мозга, 2006.

Публикации. По материалам диссертации имеется 18 печатных работ (из них 3 в рецензируемой печати).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 22 таблицы и 28 рисунков и состоит из шести разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего 206 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Описание клинического материала. Работа выполнена на образцах периферической крови пациентов, которые наблюдались в гематологическом кабинете Новосибирской областной консультативной поликлиники и проходили лечение в отделении гематологии Государственной Новосибирской областной клинической больницы с 1998 по 2006 гг. Исследовано 240 больных, из них 79 хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), 161 больной неходжкинскими лимфомами (НХЛ). Группа больных включала 135 мужчин (56,0%) и 105 женщин (44,0%) в возрасте от 17 до 86 лет (средний возраст 56,64) Лечение больных проводилось по протоколам, которые включали следующие препараты: циклофосфамид, лейкеран, адриамицин, онковин, винкристин, преднизолон. Эффективность химиотерапии оценивалась врачами ГНОКБ через 6 месяцев после установления диагноза и начала лечения. Наличие ответа на лечение определялось при полной или частичной клинико-гематологической ремиссии у больных НХЛ и ХЛЛ и в случае стабилизации у больных ХЛЛ. Отсутствие ответа на лечение определялось при прогрессировании заболевания или в случае смерти больного.

Контрольную группу составили пациенты травматологического отделения 3-й Муниципальной клинической больницы скорой помощи в период проведения контрольных анализов перед выпиской. Она включала 100 человек, из них 54 мужчины (54,0%) и 46 женщин (46,0%) в возрасте от 17 до 86 лет (средний возраст 53,47). Основным критерием отбора в контрольную группу было отсутствие каких бы то ни было онкологических заболеваний.

Методы исследования. Выделение ДНК из цельной крови проводили с помощью стандартного набора производства ООО «Лаборатория Медиген» (г. Новосибирск). Анализ полиморфных вариантов специфических участков генома проводился с использованием методов полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, используя структуру праймеров и соответствующие ферменты рестрикции, которые были описаны в литературе (Harries et al.., 1997; Harris et al., 1998; Cascorbi et al., 2001; Ito et al., 2001). Подбор эндонуклеаз рестрикции для гена MRP1 проводился с спользованием программы Vector NTI 8.0. Для обнаружения полиморфных вариантов MRP1 использовали следующие эндонуклеазы рестрикции: T1684C – AspS9I, A1218+8G – AspLEI, C2461-30G – BtrI («СибЭнзим», Россия). Продукты ферментативного гидролиза разделяли разделяли вертикальным электрофорезом в 7% полиакриламидном геле в трис-боратном буфере. Визуализацию бандов и сканирование геля проводили в проходящем УФ свете с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Москва).

Функциональная активность Р-гликопротеина была определена на проточном цитофлюориметре FACS Calibur фирмы «Becton Dickinson» с использованием субстрата родамина 123 и ингибитора верапамила в лимфоцитах в контрольной группе, которая включала здоровых европеоидов (n=49), и у больных НХЛ (n=76). Активность Р-гликопротеина (E Rh123, отн.ед.) оценивали по выбросу родамина 123, определяемому как отношение геометрических средних флюоресценции родамина 123 в присутствии верапамила и без него (Huet et al., 1998). Исследование функциональной активности MRP проводилось у здоровых (n=29) и больных НХЛ (n=31) с использованием 5(6)-диацетат карбоксифлюоресцеина в присутствии ингибитора циклоспорина А (Dogan et al., 2003). Активность MRP1 (ECFDA, отн.ед.) оценивали по выбросу карбоксифлуоресцеина, определяемому как отношение геометрических средних флюоресценции карбоксифлуоресцеина в присутствии циклоспорина А и без него.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных статистических программ «Statistica v.6» (StatSoft Inc., 1995) и программы EpiInfo 6 (1993). Распределение генотипов исследованных полиморфных локусов проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера (Вейр, 1995). Об ассоциации аллелей, генотипов и комбинаций генотипов с лимфопролиферативными заболеваниями и устойчивостью к лечению судили по величине отношения шансов (ОШ) (Флетчер и др., 1998). Достоверность различий в частотах встречаемости изучаемых признаков между анализируемыми группами оценивали по критерию 2 с поправкой Йетса на непрерывность или двухстороннему точному критерию Фишера, когда в группе сравнения было менее 5 наблюдений.

Для оценки достоверности различий между выборками с различными физиологическими и клиническими параметрами по уровню, функциональной активности P-гликопротеина и MRP использовались непараметрический критерии Манна-Уитни. В случае сравнения более чем двух групп, для оценки использовали критерий Крускалля-Уоллиса с последующим попарным сравнением по критерию Манна-Уитни, в случае, если уровень значимости различий р0,05. Корреляцию между возрастом и уровнем функциональной активности оценивали по критерию Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ


Распределение частот генотипов и аллелей генов GSTP1, MDR1 и MRP1 у здоровых европеоидов Западной Сибири и у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями

Полиморфизм A313G в 5 экзоне гена GSTP1, приводящий к замене Ile105Val, был исследован в контрольной группе (n=57) и у больных ХЛПЗ (n=163). Анализ распределения частот полиморфных вариантов гена и аллелей GSTP1 в 5 экзоне в группе контроля и у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями показал отсутствие статистически значимых различий. В группе без онкопатологии частота мутантного аллеля (0,30) была сопоставима с описанными частотами для других европеоидов 0,28-0,36 (Harries et al., 1997; Landi, 1998), ниже, чем у афроамериканцев 0,42-0,45, но выше, чем у африканцев (2=8,89, р=0,003), азиатов 0,14-0,27 (Harries et al., 1997).

Полиморфизм C341T в 6 экзоне гена GSTP1, приводящий к замене Ala114Val, был исследован у 60 индивидуумов контрольной группы и 146 больных ХЛПЗ. Анализ распределения частот полиморфных вариантов гена GSTP1 в 6 экзоне в контрольной группе и у больных ХЛПЗ показал статистически значимые различия: 2=6,79, р=0,03 для ХЛПЗ, 2=6,00, р=0,05 для НХЛ и 2=6,40, р=0,04 для ХЛЛ (рис. 1). Частота встречаемости Т341T генотипа не отличалась у больных ХЛПЗ и НХЛ от контрольной группы, а в группе больных ХЛЛ этот генотип отсутствовал.

Рис. 1. Распределение генотипов и частот аллелей полиморфного варианта C341T гена GSTP1 у больных ХЛПЗ и в контрольной группе.

Частота встречаемости мутантного T аллеля была выше в общей группе больных ХЛПЗ по сравнению с группой контроля (р=0,055) и статистически достоверно выше у больных НХЛ (р=0,049). В группе ХЛЛ также наблюдалось более высокая частота валинового аллеля, но эти различия не являлись статистически достоверными (рис. 1).

Сравнение частот генотипов C341T гена GSTP1 в нашей контрольной выборке с описанными в различных популяциях и этнических группах не выявило достоверных отличий от австралийских европеоидов и индийской популяции (Harris et al., 1998). Частота мутантного аллеля в контрольной группе (0,11) была сопоставима с таковой у австралийских европеоидов (0,07) и индийцев (0,05), но достоверно выше, чем у других среди азиатов (0,0-0,01) (Ishii et al., 1999; Harris et al., 1998).

К настоящему времени открыты и охарактеризованы более 50 однонуклеотидных замен в гене MDR1, большинство из которых является молчащими мутациями или расположены в интронных областях (Mickley et al., 1998; Ito et al., 2001; Kerb et al., 2001; Saito et al., 2002; Marzolini, 2004). Мы исследовали наиболее часто встречающиеся полиморфизмы в гене MDR1: в 6 интроне (Ex06+139C/T), 12 (C1236T), 21 (G2677T) и 26 (C3435T) экзонах. Полиморфизм G2677T приводит к замене Ala893Ser, а мутации C1236T и C3435T, являются синонимичными.

Анализ распределения полиморфных вариантов гена MDR1 в 6 интроне, 12 и 21 экзонах в группе контроля и у больных ХЛПЗ не выявил статистически достоверных различий в частотах встречаемости генотипов и аллелей. В группе без онкопатологии частоты мутантных аллелей в 6 интроне (0,44), 12 экзоне (0,47) и 21 экзоне (0,43) значимо не отличались от описанных в литературе для европеоидов Германии и России (Cascorbi et al. 2001; Hoffmeyer et al., 2000; Siegmund et al., 2002; Gaikovitch et al 2003).

Анализ распределения полиморфных вариантов гена MDR1 в 26 экзоне показал, что частоты распределения генотипов статистически значимо отличаются от контрольных в группе ХЛПЗ (2=7,15, р=0,03) и ХЛЛ (2=5,93, р=0,05), в группе ХНЛ эти отличия не достигают значимого уровня (рис. 2). Частота встречаемости мутантного аллеля в группах больных ниже по сравнению со здоровыми, причем эти различия являются статистически достоверными для всех групп (p=0,02 для ХЛЛ и НХЛ и р=0,006 для ХЛПЗ).

Частоты встречаемости мутантного аллеля в группе без онкопатологии (0,65) в 26 экзоне близки к частотам генотипов в популяции России (0.54) (Gaikovitch et al., 2003), европеоидов Англии (0.52), Португалии (0,57) (Ameyaw et al., 2001), но значительно превышают частоты мутантного аллеля у европеоидов Польши (0.38) (Jamroziak et al., 2002), Германии (0.48) (Hoffmeyer et al., 2000).

Рис. 2. Распределение генотипов и частот аллелей полиморфного варианта C3435T гена MDR1 у больных ХЛПЗ и в контрольной группе.

При исследовании частот генотипов и аллелей MRP1 в 13 экзоне (T1684C), а также в 9 (A1218+8G) и 18 (C2461-30G) интронах в контрольной группе и у больных ХЛПЗ не было выявлено статистически значимых отличий. Частота встречаемости мутантного аллеля 1684С в 13 экзоне в группе без онкопатологии (0,83) была достоверно выше частоты этого аллеля в японской популяции 0.19 (Ito S. et al., 2001) и незначительно выше частоты 1684С аллеля европеоидов Германии 0.80 (Oselin K. Et al., 2003). Частоты встречаемости мутантного аллеля в группе без онкопатологии в 9 интроне (0,33) совпали с частотой данного аллеля в японской популяции (0.34) (Ito S. et al., 2001) и европеоидов Германии (0.35) (Oselin K. et al., 2003). Частота встречаемости мутантного аллеля в контрольной группе в 18 интроне (0,78) была достоверно выше частоты данного аллеля в японской популяции 0.30 (Ito S. et al., 2001).

Роль полиморфизмов генов GSTP1, MDR1 и MRP1 в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям

При анализе полиморфизма A313G гена GSTP1 у здоровых и больных ХЛПЗ не выявлено статистически значимых ассоциаций различных генотипов с риском развития ХЛПЗ (табл. 1). Это свидетельствует о том, что ни один из генотипов A313G не является фактором предрасположенности к ХЛПЗ. Наши данные согласуются с опубликованными ранее исследованиями больных с НХЛ и ХЛЛ, где не было выявлено ассоциаций полиморфных вариантов A313G гена GSTP1 с риском развития заболеваний (Sarmanova et al., 2001).

При анализе ассоциации разных генотипов C341T GSTP1 с риском развития ХЛПЗ выявлено, что носители «дикого» генотипа 341СС 2,44 раза более устойчивы к возникновению ХЛПЗ (ОШ=0,41, р=0,02), в частности к НХЛ носители данного генотипа будут устойчивее других индивидуумов в 2,5 раза (ОШ=2,5, р=0,03) (табл. 1). Для ХЛЛ также показана ассоциация дикого генотипа с вероятностью устойчивости к заболеванию в 2,38 раза, однако необходимая статистическая достоверность не показана (р=0,09). Это можно объяснить малой выборкой исследованных больных с ХЛЛ. Генотип 341CT ассоциирован с предрасположенностью к лимфопролиферативным заболеваниям: риск заболеть ХЛПЗ у носителей этого генотипа по сравнению с остальными индивидуумами повышен в 2,78 раза (р=0,014), риск заболеть НХЛ – в 2,68 раза (р=0,026), а ХЛЛ – в 3,05 раза (р=0,037) (табл. 1). Это свидетельствует о том, что генотип 341СТ является фактором предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям, а «дикий» генотип – фактором устойчивости к ХЛПЗ, в частности к НХЛ.

Анализ ассоциаций генетических вариантов MDR1 с предрасположенностью к лимфопролиферативным заболеваниям показал, что в 6 интроне, 12 и 21 экзонах статистически значимых ассоциаций наличия мутантного аллеля с риском развития ХЛПЗ не выявлено, т.е. полиморфизмы C6+139T, C1236T и G2677T в 6 интроне не являются предрасполагающими факторами к развитию этих заболеваний (табл. 1).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»