WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

1:200

«

10

CD 44

F 10-44-2

1:50

«

Регуляторные протеины

11

Ki 67

B 56

1:10

Bioscienses

12

p 53

DO-7

1:100

DAKO

13

BAX

Кроличьи,

A 3533

1:50

«

14

Bcl X

Кроличьи,

A 3535

1:50

«

Затем срезы охлаждали 20 минут при комнатной температуре, слегка подсушивали и на них наносили первичные антитела. Инкубация с первичными антителами составляла 30 минут при комнатной температуре, затем 12 часов при 4 С. Использовались позитивные и негативные контроли – иммунные и неиммунные сыворотки. Срезы тщательно отмывали в буфере, подсушивали, затем на них наносили систему En Vision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO, Дания) или универсальный LSAB System kit (фирмы DAKO, Дания). При использовании одноступенчатой системы En Vision реактив наносился на срезы на 30-40 минут. При использовании двуступенчатого универсального авидин-стрептавидинового комплекса на срезы на 30 минут наносились вторичные антитела, которые затем промывались забуференным физиологическим раствором, а затем еще на 30 минут – пероксидазный комплекс.

После каждой инкубации срезы тщательно отмывали, подсушивали вокруг, затем, для визуализации реакции, на них наносили DAB +(3,3 диаминобензидин) или АЕС (3-амино-9этилкарбазол (фирмы DAKO), что позволяло получать соответственно специфическую коричневую или красную окраску. Интенсивность ИГХ реакции в каждом препарате контролировалась под микроскопом: по достижении необходимой интенсивности окрашивания срезы отмывали в дистиллированной воде, после чего в течение 2-5 минут докрашивали гематоксилином Майера, снова промывали и погружали в проточную воду, в которую для получения щелочной среды добавляли несколько капель нашатырного спирта.

После того, как срезы приобретали голубой оттенок, стекла извлекали, обезвоживали в батарее спиртов и ксилолов по стандартной схеме, заключали в бальзам и исследовали под микроскопом.

Системы оценки экспрессии различных ИГХ маркеров

1. Интенсивность пероксидазной метки для каждого маркера оценивали полуколичественным методом – число позитивных на 100 учтенных опухолевых клеток. Параллельно оценивали интенсивность окрашивания: + - слабое, ++ - умеренновыраженное, +++ - интенсивное.

Разработанная система оценки экспрессии тканеспецифических антигенов, адгезивных молекул и протеинов ВАХ и Bcl-X описана при изложении соответствующего материала.

Определение индексов пролиферации Ki 67, а также экспрессии протеина р 53 в ядрах клеток вычислялось как среднее от числа меченных ядер на 100 учтенных ядер ( при учете 500-1000 опухолевых клеток).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование гистогенеза, биологического потенциала и инвазивных свойств эпителиальных опухолей толстой кишки проводилось на основании гистологического исследования в соответствии с классификацией эпителиальных новообразований толстой кишки (ВОЗ, 2000), а также молекулярно-генетических особенностей клеток новообразований.

Исследование фенотипа клеток АК

Исследовано 5 тубуло-ворсинчатых аденом с признаками дисплазии эпителия желез слабой и умеренной степени.

Аденокарциномы ТК в зависимости от выраженности железистых структур, а также от клеточного и ядерного полиморфизма делят на высоко-, умеренно- и низкодифференцированные опухоли. Однако подобное разделение является в определенной степени условным и не дает полной информации об инвазивном потенциале клеток АК. [ А.Г. Перевощиков, 1997]

Таблица 2. Распределение аденокарцином толстой кишки на группы по степени дифференцировки и на основании клинической стадии заболевания.

Стадия опухолевого развития

Аденокарциномы

Всего

высокодифференцированные

умереннодифференцированные

низкодифференцированные

II

T3N0M0

8

61%

9

69%

11

25%

20

45%

0

1

11%

30

45,5%

T4N0M0

1

8%

9

20%

1

11%

III

T3N1M0

2

15%

4

31%

7

16%

18

41%

1

11%

6

67%

28

42,5%

T4N1M0

1

8%

7

16%

2

22%

T3-4N2-3M0

1

8%

4

9%

3

33%

IV

T3-4N1-3M1

0

6

14%

2

22%

8

12%

Всего

наблюдений

13

20%

44

66%

9

14%

66

Клинически в соответствии с Международной классификацией по системе TNM АК ТК были разделены на 4 группы, в которой Т-степень инвазии, N-метастазы в регионарные лимфатические узлы и М-отдаленные метастазы [В.Л.Черкес, 2001; C.C.Compton, 2000]. Всего было исследовано 66 АК ТК.

Самую многочисленную группу опухолей составили АК умеренной степени дифференцировки – 66% (44 из 66) ( таблица.2). Характерно, что большинство ВД АК ТК в (69% случаев, 9 из 13) выявлялись во II стадии, их не было в IV клинической стадии, а большинство НД АК (89% наблюдений, 8 из 9) выявлялись в поздних стадиях - III и IV.

При сравнительной клинико-морфологической оценке АК ТК была выявлена обратная корреляция между такими параметрами опухолевой прогрессии, как степень дифференцировки и клиническая стадия заболевания

Исследование экспрессии тканеспецифических маркеров в клетках эпителиальных опухолей ТК

В клетках исследованных эпителиальных опухолей ТК (ТВА и АК ТК) наблюдалась выраженная экспрессия цитокератинов широкого спектра в цитоплазме, канцеро-эмбрионального и эпителиально-мембранного антигенов в просвете желез, в цитоплазме и на мембране клеток.

Экспрессия цитокератинов 19 и 20. Цитокератины 19 и 20 типа относятся к промежуточным филаментам и составляют структурную основу эпителиальной клетки [P.A Coulombe et al, 2002]. СК 20 в норме выявляется в эпителиоцитах слизистой тонкой и толстой кишки и является маркером зрелых энтероцитов [ P.Tamboli et al, 2002 ]. Цитокератин 19 выявляется в более широком спектре тканей: в многослойном плоском, протоковом и железистом эпителии [R.Moll et al, 1982].

В результате проведенного исследования было выявлено, что в эпителии нормальной слизистой ТК экспрессия цитокератинов имела некоторые топографические особенности. СК 20 выявлялся преимущественно в клетках апикальных отделов крипт, тогда как СК 19 отмечался в эпителиальных клетках вне зависимости от зональной принадлежности крипты, хотя реакция в поверхностных участках слизистой ТК была более интенсивной.

В клетках ТВА экспрессия исследуемых цитокератинов была достаточно равномерной, интенсивной и обнаруживалась как в поверхностных, так и в центральных отделах опухолей.

В клетках АК ТК отмечалась неоднородность экспрессии СК 19, которая отличалась и по интенсивности, и по локализации в клетке. В связи с этим была разработана система оценки экспрессии СК 19: равномерная экспрессия более, чем в 90% клеток - 1 балл; цитоплазматическая экспрессия более, чем в 50% клеток - 2 балла; цитоплазматическая экспрессия менее, чем в 50% клеток - 3 балла.

Нами было выявлено, что при уменьшении степени дифференцировки опухолей наблюдалось уменьшение интенсивности экспрессии СК 19. В группе ВД АК интенсивная иммунореактивность к СК 19, которая отмечалась в нормальной неповрежденной слизистой ТК, была обнаружена в 43% ( 6 из 14) случаев, в группе УД АК количество наблюдений с выраженной экспрессией СК 19 уменьшилось в полтора раза (35% - 11 из 31), а в группе НД АК – в 3 раза (14% - 1 из 7) (рис.1).

Экспрессия СК 20 в АК ТК также была неравномерной, но выявлялась как в центральных, так и периферических участках опухолей. В связи с этим оценка иммунореактивности СК 20 проводилась с учетом следующих критериев: цитоплазматическая экспрессия более, чем в 70% опухолевых клеток - 1 балл; цитоплазматическая экспрессия не менее, чем в 50% клеток - 2 балла; цитоплазматическая экспрессия менее, чем в 30% клеток - 3 балла.

В группе ВД АК экспрессия СК 20 была интенсивной (1 балл) в клетках 11% (1 из 9) АК, в клетках УД АК этот показатель соответствовал 10% (3 из 29) случаев, в НД АК данный тип экспрессии отсутствовал.

Итак, было обнаружено, что при снижении степени дифференцировки опухолевых клеток уменьшается процент позитивных клеток, т.е. содержания СК 19 и 20 в опухолевой ткани, тогда как характерной закономерности в экспрессии протеинов в клетках эпителиальных опухолей ТК в зависимости от клинической стадии выявлено не было.

Рис 1. Зависимость гиперэкспрессии цитокератинов от степени дифференцировки клеток

Экспрессия муцинов 1 и 2 типа в клетках эпителиальных опухолей ТК

Муцины – семейство высокомолекулярных гликопротеинов, которые выявляются в железистом эпителии и являются одним из основных компонентов слизи в респираторном, пищеварительном и урогенитальном тракте, выполняя защитную функцию [J.Perez-Vilar et al, 1999].

Муцин 2 типа относится к секреторным муцинам и в норме секретируется в бокаловидных клетках кишечника [A.Velcich, 1997], тогда как муцин 1 типа появляется только при дисплазии эпителия слизистой, и в клетках нормальной слизистой толстой кишки не выявляется [C Carrato et al, 1994].

В клетках ТВА отмечалась выраженная экспрессия MUC2 в поверхностных и в центральных отделах опухоли, тогда как иммунореактивности к MUC1 выявлено не было.

Шкала полуколичественной балльной оценки экспрессии муцинов 1 и 2 типов разрабатывались нами с учетом экспрессии протеинов в клетках нормальной слизистой, в связи с чем они представляют собой противоположные последовательности.

Оценка экспрессии MUC1: отсутствие экспрессии (как в норме) - 0 баллов; экспрессия локализовалась в просвете менее 50% опухолевых желез - 1 балл; экспрессия локализовалась в просвете более 50% опухолевых желез - 2 балла; экспрессия локализовалась в просвете желез и цитоплазме менее, чем в 50% опухолевых клеток - 3 балла; в просвете желез и цитоплазме более, чем в 50% опухолевых клеток - 4 балла.

В ткани АК ТК экспрессия MUC1 была гетерогенной: выявлялась в слизистом содержимом просвета желез, на апикальной поверхности мембран железистых клеток и/или в цитоплазме опухолевых клеток.

В зависимости от клинической стадии опухоли ТК отмечалось тенденция к увеличению накопления MUC1 в тканях АК ТК: во II стадии в 17% (3 из 18) случаев выявлялась экспрессия в цитоплазме опухолевых клеток, в III стадии - в 35% (7 из 20) случаев, в IV стадии число позитивных случаев увеличивалось до 43% (3 из 7) случаев.

Оценка экспрессии MUC2 в клетках АК ТК: антиген экспрессировали более 30% клеток опухоли - 1 балл; антиген экспрессировали 10-30% клеток - 2 балла; антиген экспрессировали менее 10% клеток - 3 балла; единичные клетки, не более 3% - 4 балла;

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»