WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 8 |

2.2.2 Характеристика биологических свойств эпизоотических штаммов вирусов классической чумы свиней и болезни Ауески

Целью исследований явилось изучение биологических свойств эпизоотических штаммов вирусов КЧС и БА для определения их патогенных свойств и пригодности к использованию в качестве контрольных.

Контрольный штамм «Ши-мынь» был получен из ВНИИВВиМ. Согласно паспортным данным он отнесен к семейству Flaviviridae, род Pestivirus, вид Mucosal disease pestivirus, РНК-геномный. Патогенность штамма определяли на поросятах. Эти исследования показали, что у всех животных клинические признаки заболевания проявились через 3-4 дня после введения вируса. При этом наблюдался симптомокомплекс болезни характерный для КЧС: лихорадка (41,5-42 С), угнетение, жажда. Отмечались кровоизлияния в коже в области шеи, паха. При вскрытии убитых и павших поросят наблюдали гемморрагический синдром, проявлявшийся множественными кровоизлияниями в серозных оболочках внутренних органов, на слизистой оболочке желудка, тонкого и толстого отделов кишечника, гортани, а также мочевого пузыря. Лимфатические узлы были увеличены, на разрезе имели мраморный рисунок с гиперплазией фолликулов.

Многократные повторности опытов по изучению патогенности штамма показали, что практически в 100% случаев он вызывал заболевание и гибель животных с признаками острой формы болезни. Титр вируса на поросятах установлен на уровне 6,5 lgЛД50/см3.

Таким образом, результаты исследований свидетельствует о том, что штамм «Ши-мынь» обладает выраженными патогенными свойствами и может использоваться для проверки иммуногенности вакцин против КЧС.

Штамм «Кордай» вируса БА был выделен в 1996 г. от больных свиней на свиноводческой ферме АО «Достык» Кордайского района Жамбылской области. Данный штамм культивируется в организме овец, свиней, кроликов, КРС, пушных зверей, плотоядных и культурах клеток ПЯ, ВНК в титрах до 7,5 lg ТЦД50/см3. Цитопатогенное действие данного штамма в культуре клеток проявляется округлением клеток с последующим разрушением монослоя.

Сравнительная характеристика биологических свойств эпизоотических штаммов вируса БА представлена в таблице 2.

Таблица 2 – Сравнительная характеристика биологических свойств эпизоотических штаммов вируса БА

№ п/п

Показатели

Штаммы вируса болезни Ауески

ВНИЯИ

Кордай

1

Культуральные

ПЯ-6,0 lg ТЦД50/см3.

ПЯ, ВНК-21-7,5 lg ТЦД50/см3

2

Характер и сроки проявления ЦПД

24-36 часов, «гроздья винограда»

18-36 часов, «гроздья винограда»

3

Метод культивирования

стационарный

стационарный

4

Антигенные

не изучали

стимулирует образование ВНА в титре до 1:128

5

Условия и сроки хранения

-40С

-20С; -40С

6

Инфекционная активность

на кроликах - 6,5 lg ЛКД50

на кроликах - 6,5-7,0 lg ЛКД50

7

Патогенность

штамм по паспортным данным патогенен для овец и КРС.

высоко патогенен для овец, кроликов, крупного рогатого скота, пушных зверей, плотоядных.

Таким образом, предложенный штамм «Кордай» вируса БА отличается высокой цитопатогенностью (7,5 lgТЦД50/см3) и патогенностью для животных и может быть использован для проверки иммуногенности выпускаемых вакцин.

Выделение и изучение биологических свойств вирусов осуществляли с использованием развивающихся куриных эмбрионов, культуры клеток, лабораторных и восприимчивых животных.

В процессе выполнения этих исследований нами разработана полезная модель «Электросверло для нанесения отверстий в скорлупе куриного эмбриона», использование которой облегчает труд исследователя и стандартизирует проводимые процессы. На данную полезную модель получен предварительный патент №56103 от 28.05.2008 г. Разработанная полезная модель нашла применение в производстве.

2.2.3 Отработка оптимальных условий получения высокоактивного вируссодержащего материала вируса классической чумы свиней

Для получения активной вирусной массы вначале подбирали биологические модели культивирования. С этой целью проводились попытки по адаптации лапинизированного штамма «КТ» к культурам клеток РК-15, ТЯ, ТП, обработанных ПЭГ-6000. Культивирование вируса проводили стационарным, роллерным методами и методом пересева инфицированного пласта клеток. В каждой культуре клеток каждым способом проведено 10 адаптационных пассажей. При этом длительность цикла культивирования продолжалась 96-120 ч, а иногда более. В итоге получены различные варианты вируссодержащей суспензии, проверка иммуногенных свойств которых показала ее отсутствие. Поэтому в дальнейших экспериментах изучали накопление штамма вируса КЧС Pestis suum «КТ» в организме кроликов. Исследования были направлены на определение периода сбора вируссодержащего материала, обеспечивающего максимальное накопление вируса. При инфицировании лапинизированным штаммом «КТ» кроликов весом 2,5-3 кг было обнаружено, что, начиная со вторых суток, у них проявляется гипертермия (от 39,6оС до 42оС), которая продолжается на протяжении от 1 до 2 суток. В результате были определены инфицирующая доза штамма «КТ» для кроликов (не менее 102,0 ИД50/гол), сроки убоя кроликов для получения вируссодержащего материала (3 суток после инфицирования), при этом температура кроликов должна быть не ниже 40С, при которой необходимо проводить их убой для получения материала. Кроме того, отрабатывались и другие приемы и параметры технологии приготовления вакцины (замораживание органов кролика, взятых в качестве вирусного материала при температуре минус 40С), промывка рабочим солевым раствором сгустков фибрина для большего извлечения вируса, режим измельчения органов кроликов (кишечные лимфоузлы, селезенка), степень разведения полученной суспензии, режим центрифугирования для отделения измельченных тканей. Активность вакцины, полученной в конечном итоге, при титровании на кроликах оказалась 104.0 ИД50. Подкожное введение препарата подсвинкам живым весом 30-35 кг в разведениях 1:10 и 1:100 не вызывало у последних каких–либо клинических признаков заболевания и других нежелательных отклонений от физиологических норм. Проверка стерильности показала, что она является свободной от посторонней микрофлоры и плесени. Контрольное заражение подсвинков, привитых вакциной в разведении 1:100 на 21 сутки после введения препарата вирулентным штаммом Ши-Мынь вируса КЧС показало, что испытуемая вакцина является иммуногенной и предохраняет свиней от КЧС.

Таким образом, получение активного вируссодержащего сырья (кровь, селезенка, лимфоузлы) штамма вируса КЧС Pestis suum «КТ» предусматривает проведение сбора вируссодержащего материала с 28 часа до 72 час после заражения кроликов. Биологическая активность штамма в готовом продукте составляет 3,75-4,5 lgИД50/см.

2.2.4 Определение оптимальных параметров культивирования вируса болезни Ауески в культурах клеток

С целью выбора оптимальных условий культивирования вируса БА штамм «УБ-95», нами изучены степень его накопления в различных культурах клеток и цитопатическая активность в процессе пассирования в культурах клеток. С целью определения стабильности свойств и возможности использования генераций культуры клеток ФКЭ разного пассажного уровня изучали культральные свойства штамма, а также влияние питательных сред на накопление вируса в культурах клеток. Указанные исследования позволили осуществить выбор оптимального клеточного субстрата, питательной среды и способа культивирования клеток и вируса для получения сравнительно активных вируссодержащих масс штамма «УБ-95».

Из всех испытанных культур клеток наиболее чувствительными к штамму «УБ-95» оказались первичные культуры клеток ФКЭ, ПК и перевиваемые клетки ВНК-21. ЦПЭ вируса в указанных культурах клеток проявлялась через 20-24 часа, после их инфицирования и через 36-48 часов поражалась большая часть (80-90%) площади клеточного монослоя. Цитопатическая активность вируса, полученного в указанных культурах клеток, варьировала в пределах 108,00 - 108,33 lgТЦД50/СМ3. Культуры клеток ТЯ, ПЯ, ПП, ПО, РК-15, СПЭВ обладали сравнительно меньшей чувствительностью к вирусу БА. Вирус в них накапливался в титре от 105,25 до 107,25 lgТЦД50/СМ3 в течение 48-96 ч.

Таким образом, исследования показали возможность получения активного вирусного сырья штамма «УБ-95» в культурах клеток ФКЭ, ПК и ВНК-21 с использованием питательной среды ПСП.

Результаты исследований по изучению размножения вируса в субкультуре клеток КФ разного пассажного уровня позволили заключить, что для получения сравнительно активных вирусных материалов штамма «УБ-95» (с титром не ниже 108,0ТЦД50/см3) можно использовать не только первичную культуру клеток ФКЭ, но и их субкультуры 1-10 пассажей. Оказалось, что клетки субкультур по сравнению с первичными, значительно активнее пролиферируют и быстрее формируют клеточный монослой.

С целью определения оптимальных условий культивирования штамма «УБ-95» вируса БА проведены исследования с использованием линии клеток ВНК-21 при роллерном, стационарном, суспензионном, роллерно-суспензионном способах с целью определения метода, который обеспечивал бы максимальный выход вируса при минимальных затратах времени и средств. Множественность инфицирующей дозы в опытах составляла 0,01-0,1 ТЦД50/кл. В результате, при суспензионном и роллерно-суспензионном способах, титры вируса были сопоставимыми и колебались в пределах 8,00-8,25 lgТЦД50/см3, при сроках сбора вируса через 24-36 ч. после инфицирования. При стационарном культивировании титр вируса был пределах 7,75-8,00 lgТЦД50 /см3, при сроке культивирования 36-48 ч.

Таким образом, при сравнении роллерного, стационарного, суспензионного и роллерно-суспензионного способов культивирования в наибольших титрах вирус накапливается при роллерном способе, уровень накопления вируса в суспензии и стационарных однослойных культурах приблизительно одинаков.

2.3 Изучение иммуногенной эффективности вирусвакцин против классической чумы свиней и болезни Ауески

2.3.1 Иммунобиологические свойства вирусвакцин против классической чумы свиней и болезни Ауески

Иммуногенную активность вирусвакцин против КЧС и БА изучали на подсвинках и овцах. С этой целью вакцинировали подсвинков в дозах 100, 500, 1000, 5000 ИД50 вакциной против КЧС внутримышечно и в дозах 50, 100, 1000, 10000, 100000 ТЦД50 вакциной против БА, подкожно. Через каждые 7 суток после вакцинации и перед контрольным заражением собирали сыворотки крови для определения антител к вирусу КЧС в ИФА и антител к вирусу БА в РН.

Через 21 сутки после вакцинации всех животных опытной группы и по 2 интактных (контрольных) подсвинков и овец подвергали контрольному заражению вирулентным вирусом путем внутримышечного введения штамма «Ши-Мынь» вируса КЧС и штамма «Кордай» вируса БА.

У всех привитых вакциной против БА были обнаружены вируснейтрализующие антитела в титрах от 1:2 до 1:16 в различные сроки после вакцинации, за исключением тех случаев когда животных прививали в дозе 100 ТЦД50, у которых через 7 суток после вакцинации нейтрализующие антитела не были выявлены. У животных, вакцинированных в дозе 50 ТЦД50, не были установлены нейтрализующие антитела во все исследуемые сроки. В связи с тем, что вакцинированные подсвинки не реагировали на контрольное заражение, то иммуногенность для свиней оценивали по корелляции между титрами ВНА у иммунизированных овец и подсвинков, которые были сопоставимы. Данные контрольного заражения показали, что животные, вакцинированные в дозах 100, 1000, 10000, 100000 ТЦД50, устойчивы к вирулентному вирусу, в то время как животные контрольной группы (овцы) заболевали БА и погибли с характерными клиническими признаками болезни к 7-10 суткам наблюдения, как и овцы, привитые в дозе 50 ТЦД50.

Результаты ИФА с вирусом КЧС показали, что в сыворотке крови опытных животных титры антител составили по степени потенциальной инертности более 50% на 5-7 сутки. При контрольном заражении вирулентным вирусом КЧС подсвинки оказались устойчивыми к заболеванию.

Другую важную характеристику вакцины - безвредность, определяли путем подкожного введения животным вирусвакцин в объеме 5 мл с титром 3,5-4,25 ИД50/см3 вируса КЧС и 8,0-8,50 lg ТЦД50/см3 вируса БА. В течение 14-21 суток вели клиническое наблюдение за животными.

Результаты исследований показали, что животные не реагировали на введение повышенных доз вирусвакцин. Исключение составляла группа животных, привитая вакциной против БА в дозе 5х108,0-8,5 lg ТЦД50/см3. Животные данной группы реагировали кратковременной лихорадкой и образованием припухлостей в месте введения препарата диаметром 1-2 см, которые исчезли к 7-10 суткам.

Полученные сведения позволяют утверждать, что вакцины против КЧС и БА, слабореактогенны и безвредны для подсвинков и овец.

Результаты экспериментов по определению сроков наступления иммунитета показали, что у животных, привитых в дозе не менее 500 ИД50 против КЧС и 10 000 ТЦД50, вирусвакциной против БА, изготовленной в культурах клеток ФКЭ и ВНК-21 иммунитет вырабатывается на 5 сутки после вакцинации достаточно высокой напряженности, которая продолжается до 150 и 360 суток, соответственно (срок наблюдения).

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 8 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»