WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Установлено, что гликозиды витамина С и витамина Е способны снижать токсическое действие высоких доз циклофосфана на тимус и селезенку у мышей, а также способствуют более быстрому восстановлению уровня лейкоцитов периферической крови и клеток костного мозга в условиях циклофосфан-индуцированной иммунодепрессии.

Получены новые данные о способности гликозидов витамина С и витамина Е снижать одно из специфических осложнений химиотерапии – нейротоксичность. Приоритет полученных данных подтвержден патентом РФ №2286777 от 10 октября 2006 г “Способ снижения нейротоксичности радиосенсибилизатора саназола в эксперименте”.

Впервые показано, что введение гликозидов витамина С и витамина Е мышам, облученным в сублетальной дозе, умеренно защищает клетки костного мозга и крови в острый период радиационного воздействия и стимулирует процессы восстановления кроветворения, что можно рассматривать как один из основных механизмов радиопротекторного и антитоксического действия изучаемых агентов.

Получены оригинальные данные о том, что гликозид витамина С препятствует ингибированию спонтанной пролиферации лимфоцитов в условиях окислительного стресса in vivo и in vitro.

Установлено, что защитное действие гликозида витамина С в условиях окислительного стресса, индуцированного радио- и химиотерапией, обусловлено нормализацией редокс состояния глутатиона.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Полученные результаты расширяют представление о механизмах антитоксического действия модифицированных витаминов - гликозидов витамина С и витамина Е при химиотерапии и лучевом воздействии.

Они могут явиться основой для разработки новых методов коррекции побочных эффектов лекарственной и лучевой терапии, что позволит повысить качество жизни и эффективность лечения онкологических больных.

Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение клинической апробации гликозида витамина С в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями для снижения побочных эффектов химио- и радиотерапии.

Положения, выносимые на защиту:

Гликозиды витамина С и витамина Е способны повышать эффективность терапии злокачественных опухолей циклофосфаном и снижать выраженность токсических проявлений химио- и радиотерапии.

В основе радиопротекторного и антитоксического действия модифицированных витаминов лежит их способность стимулировать восстановление кроветворения и функциональной активности клеток иммунной системы.

Антитоксическое действие гликозида витамина С при противоопухолевой терапии обусловлено его способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов и нормализовать редокс состояние глутатиона.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных отчетных конференциях молодых ученых НИИ онкологии СО РАМН в 2003, 2005, 2006, 2009 гг, конференции, посвященной 70-летию биолого-почвенного факультета ТГУ (Томск, 2003), V и VI конгрессе молодых ученых и специалистов “Науки о человеке” (Томск, 2004, 2005), 10, 12, 13-ой международной конференции по повышению эффективности противоопухолевого лечения “Annual meeting on the sensitization of cancer treatment”(Киото, Япония, 2004, 2006, 2007), 13 международном конгрессе по приполярной медицине “Проблемы фундаментальной и прикладной медицины” (Новосибирск, 2006), VII международной конференции “Биоантиоксидант” (Москва, 2006), 1 и 2-ой конференции японского общества по радиопротекции “Radioprotection (Human-Defense) Society” (Киото, Япония, 2007, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 2 – в центральных журналах, рекомендуемыми “Перечнем…” ВАК Минобрнауки. Получен патент на изобретение №2286777 от 10 ноября 2006 г “Способ снижения нейротоксичности радиосенсибилизатора саназола в эксперименте”.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, содержащего 268 источников, из них российских 81, иностранных 185. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 21 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились в рамках проекта международного агентства по атомной энергетике (МАГАТЭ).

Экспериментальные животные

Эксперименты выполнены на 1134 мышах I категории разводки лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии Сибирского отделения РАМН (сертификат имеется) обоего пола в возрасте 8-14 недель, массой 18-24 г. Используемые линии мышей С57Bl/6J (H-2b), (CBAxС57Bl/6J)F1 (H-2b/k). Животных содержали на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Лаб. Животные, 2004).

Для получения исследуемого материала мышей забивали методом цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Каждый эксперимент был проведен, по крайней мере, дважды.

Препараты, используемые в работе

Гликозид аскорбиновой кислоты (2-O-a -D-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота) или AAG (Hayashibara Company, Япония) был синтезирован из аскорбиновой кислоты и мальтозы или олигосахаридов путем трансгликозилирования ферментов (Yamamoto I. et al., 1990; Yamamoto I. et al., 1990; Aga H. et al., 1991; Mandai T. et al., 1992) и любезно предоставлен профессором В.Т. Кагией (Health Research Foundation), Киото, г. Япония. Экспериментальные данные in vitro показали, что AAG проявляет меньшую цитотоксичность, чем аскорбиновая кислота в высоких концентрациях (более 0,5 мМ) (Fujinami Y., Tai A., Yamamoto J., 2001).

Водорастворимый витамин Е (TMG), гликозид витамина Е (ССI Company, Япония) был синтезирован из 2-гидроксиметил-2,5,7,8-тетраметилхроман-6-ол и мальтозы в растворе с содержанием DMSO путем трансгликозилирования с -гликозидазой из Saccaromyces species. Гликозилированный продукт был идентифицирован как 2- (-D-глюкопиранозил)метил-2,5,7,8-тетраметилхроман-6-ол. В отличие от витамина Е TMG обладает высокой растворимостью в воде (>1х103 мг/мл), проявляет более высокую антирадикальную активность по сравнению с -токоферолом и его водорастворимым аналогом - тролоксом (Murase H. et al., 1997).

В качестве препаратов сравнения использовали аскорбиновую кислоту и витамин Е (Sigma).

Циклофосфан – N`-бис-(-Хлорэтил)-N`-O-триметиленовый эфир диамида фосфорной кислоты «ЛенсФарм», Москва). Сам циклофосфан не обладает цитотоксическим действием. В результате биотрансформации в печени из него образуются активные метаболиты (фосфамид и акролеин), которые оказывают противоопухолевое действие, атакуя нуклеофильные центры белковых молекул, образуя поперечные сшивки между молекулами ДНК и блокируя митоз в опухолевых клетках (Kehrer J., Biswal S., 2000). Препарат обладает иммунодепрессивным действием (Cupps T. et al., 1982; Ballas Z., 1986).

Саназол (АК-2123) [(N-2’-(метоксиэтил)-2-(3’-нитро-1’-триазолил)ацетамид] - был любезно предоставлен проф. Кагией, Киото, Япония. Саназол – гипоксический радиосенсибилизатор из класса соединений нитротриазолов, полученный в Киотском университете (Япония), преимущество которого по сравнению с его аналогом мисонидазолом заключается в практическом отсутствии токсичности терапевтических доз (Sakano K. et al., 1986). В то же время положительные результаты по эрадикации солидных опухолей при интенсивном режиме введения высоких доз саназола нередко приводят к проявлению нейротоксичности (Kagiya V.T., 2006).

Дизайн экспериментов

Способность модифицированных антиоксидантов модулировать эффективность цитостатической терапии экспериментальных злокачественных новообразований изучали на мышах с гематогенно-метастазирующей в легкие карциномой легких Льюис (LLC), полученной из банка опухолевых штаммов РОНЦ РАМН (г. Москва). Данная опухолевая модель является адекватной для изучения противоопухолевой и антиметастатической активности препаратов (Методические рекомендации по доклиническому изучению средств,…, Москва, 2005).

При терапии экспериментальных опухолей циклофосфан инъецировали внутрибрюшинно двукратно в дозе 120 или 60 мг/кг на 3-и и 7-е сутки после трансплантации опухоли. Группе животных без введения цитостатиков по аналогичной схеме инъецировали эквиобъемные количества физиологического раствора. Гликозид аскорбиновой кислоты, в дозе 50 мг/кг или гликозид витамина Е в дозе 100 мг/кг вводили на протяжении роста опухоли со 2-го дня после перевивки.

Иммунодепрессию у мышей С57Bl/6 моделировали путем однократной внутрибрюшинной инъекции циклофосфана в максимально переносимой дозе 250 мг/кг. Введение гликозидов витамина С в дозе 50 мг/кг или витамина Е в дозе 100 мг/кг начинали со дня инъекции циклофосфана и продолжали в течении 4-7 дней. Для определения уровня показателей у животных без иммунодепрессии использовали группу здоровых мышей, которым вводили физиологический раствор по схеме, аналогичной введению антиоксидантов.

В качестве экспериментальной модели нейротоксичности использовали однократное внутрижелудочное введение саназола в токсической дозе 2,1 г/кг. Для оценки нейротоксического действия саназола служил тест “открытого поля” (Буреш Я. И и др., 1991). Эффективность применяемых воздействий оценивали по поведенческим реакциям (вертикальная, горизонтальная и локомоторная активность) до воздействия, на 1-е и 2-е сутки после введения препаратов. AAG вводили в дозе 50 мг/кг, перорально, TMG в дозе 100 мг/кг, внутрибрюшинно, контрольной группе вводили физиологический раствор за 30 минут до введения саназола.

Для изучения влияния модифицированных витаминов на побочные эффекты рентгеновского излучения у мышей использовали тотальное облучение в сублетальной дозе (доза облучения составила 5,6 Гр, при мощности дозы 0,5 Гр в минуту) на рентгеновском аппарате РУМ-17 (фильтр 0,5 мм. меди + 1,0 мм. алюминия, напряжение на трубке 200 кВ, анодный ток 5 мА).

Для изучения влияния модифицированных витаминов на систему кроветворения и пролиферацию лимфоцитов AAG или витамин С вводили перорально в дозе 100 мг/кг за 60 минут до облучения, TMG вводили внутрибрюшинно в дозе 600 мг/кг непосредственно сразу после облучения. Контрольной группе вводили эквиобъемные количества физиологического раствора по аналогичным схемам. Эффективность воздействия модифицированных антиоксидантов оценивали по динамике восстановления клеток крови и костного мозга, и иммунологическим показателям на 3, 7, 14 и 21-е сутки после облучения, в соответствии со стандартными гематологическими методами (Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П., 1992)

Окислительный стресс в изолированных спленоцитах in vitro индуцировали гидроперекисью водорода.

Методы исследования

Для перевивки карциномы легких Льюис использовали стерильно выделенные опухолевые клетки по 1 млн. в 0,2 мл среды 199, которые вводили внутримышечно в бедро правой задней лапы.

Оценку эффективности терапевтических воздействий на животных-опухоленосителях проводили по торможению роста первичной опухоли и ингибированию метастазирования. Рассчитывали следующие показатели:

- торможение роста опухоли (ТРО, %):

ТРО = М0-Мк/Мк х 100%, где Мк и М0 – масса опухоли в контрольной (без лечения) и опытной группах;

- индекс ингибиции метастазирования (ИИМ, %) – интегральный показатель, рассчитываемый по формуле: ИИМ = (Ак Вк - АоВо) 100 / (Ак Вк, где Ак Ао) - Ак и Ао – доля мышей с метастазами в контрольной и опытной группах, Вк и Во – среднее количество метастазов в легких (в тех же группах);

- торможение роста метастазов (ТРМ, %): ТРМ = (Sk – So)/ Sk, где Sk и So – суммарная площадь метастазов в контрольной и опытной группах.

Определение уровня аскорбиновой кислоты в плазме крови и в головном мозге мышей проводили методом, предложенным Brubacher G. and Vuilleumier J.P. (1974). Интенсивность флюоресценции измеряли на спектрофлюориметре Hithachi – 750 (Япония).

Гидроперекиси липидов в селезенке мышей определяли FOX-2 методом (Hermes-Lima M., Willmore W.G., Storey K.B., 1995), основанным на способности гидропероксидов липидов окислять ионы Fe2+ при низком значении РН, в результате чего образуется комплекс Fe3+-ксиленолоранж[о-крезолсульфонфталеин-3`,3``-бис(метилиминоди-ацетата натриевая соль], имеющий максимум поглощения при 580 нм. Оптическую плотность регистрировали на СФ-2000 (Россия). В качестве стандарта использовали гидроперекись кумола («Merk», Германия).

Содержание уровня общего, восстановленного и окисленного глутатиона определяли высокоспецифичным и чувствительным циклическим методом, предложенным M. E. Anderson (1985). Кинетику реакции регистрировали на СФ-2000 (Россия). Уровень восстановленного и окисленного глутатиона выражали в мкмоль/мг белка и рассчитывали отношение GSH/GSSG.

Определение количества белка проводили по методу M.M. Bradford (I994) с использованием красителя Coomassie G-250.

Определение спонтанной пролиферации спленоцитов мышей проводили по включению меченного радионуклидами предшественника синтеза нуклеиновых кислот [3Н]-тимидина (Изотоп) в ДНК. Включение [3Н]-тимидина (радиоактивность) в ДНК исследуемых клеток измеряли с использованием планшетного микро--счетчика («Wallac», Голландия) и выражали в импульс/мин.

Статистическая обработка результатов

Все полученные данные подвергали математической обработке, используя методы вариационной статистики. Вычислялось: среднее значение, среднее квадратичное отклонение, ошибка среднего значения. Значимость различий показателей между группами оценивали с использованием непараметрического критерия Вилкоксона - Манна – Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05 (Реброва О.Ю., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние гликозидов витамина С (AAG) и витамина Е (TMG) на эффективность циклофосфана у мышей с карциномой легких Льюис

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»