WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

3. Влияние серотонина на активацию МАРK/ERK в идентифицируемых нейронах виноградной улитки.

С целью изучения вклада серотонинэргической системы в активацию MAPK/ERK в отдельных нейронах, участвующих в организации оборонительного поведения и обучении, провели исследования in vitro. Для этого ЦНС инкубировали в физиологическом растворе с добавлением серотонина (1X10-4M) в течение 3,5 часов. Известно, что длительная инкубация ЦНС моллюсков в данных концентрациях серотонина моделирует процесс долговременной сенситизации, лежащий в основе формирования оборонительных рефлексов. Чтобы убедиться в специфичности эффекта активации MAPK/ERK часть экспериментов проводили с добавлением ингибитора MAP-киназного каскада PD 98059 (Cell Signaling) (20 мкМ). (Рис. 8)

Из рисунка 8 видно, что наблюдается серотонин-индуцируемая активация MAPK/ERK в процеребруме (F(2,18)=14,05, p<0,01, ANOVA) и в командных нейронах оборонительного поведения правого париетального ганглия (ППа(2/3)), (F(2,13)=10,86, p<0,01, ANOVA). Активация снимается блокатором МAP-киназного каскада PD98059. В командных нейронах левого париетального ганглия (ЛПа(2/3)) активация MAPK/ERK практически не отличается от контроля (1,14±0,31; p<0,80), как и в нейронах пула Д (1,37±1,82; p=0,10). В группе Н увеличение выражено меньше, чем в процеребруме или командных нейронах ППа(2/3), но достоверно (F(2,15)=6,16, p<0,01, ANOVA). Таким образом, серотонин-индуцируемая активация MAPK/ERK наблюдается в различных функциональных группах нейронов и сходна с активацией MAP-киназ в этих нейронах при формировании условного рефлекса пищевой аверзии.

4. Сравнение активации MAPK/ERK при обучении ювенильных и взрослых Helix.

В следующей серии экспериментов был проведен сравнительный анализ экспрессии и активации MAPK/ERK после обучения у взрослых и ювенильных (2-3 месячных) животных. Известно, что улитки в этом возрасте не способны к выработке условных оборонительных рефлексов (Zakharov and Balaban, 1987). Сравнение экспрессии и активации ERK в париетовисцеральном комплексе ганглиев взрослых и ювенильных животных проводили спустя 10 минут, 1 час, 2 час или 3,5 часа после обучения (Рис. 9). В качестве контроля использовали наивных животных. Так как ганглии ювенильных животных малы, их объединяли по два в каждом образце.

Обнаружили, что базальная экспрессия ERK у ювенильных и взрослых животных сходна. Однако уровень активации ERK у этих групп животных существенно отличался (рис. 9). По результатам двухфакторного анализа ANOVA (возраст (2)*время (5)) обнаружены достоверные отличия по возрасту (F(1, 68)=158, p<<0,001), по времени (F(4, 68)=7,1, p<<0,001) и эффекту взаимодействия (F(4, 68)=7,2, p<<0,001). У наивных ювенильных животных уровень активации ERK по сравнению с наивными взрослыми существенно ниже (F(1, 21)=19; p<0,001). Более того, активация ERK в ЦНС взрослых животных значительно возрастает через 10 минут и через час после обучения, по сравнению с наивными взрослыми F(1, 12)=15, p<0,003 и F(1, 12)=10; p<0,008, соответственно. В то время как у ювенильных улиток повышение уровня активации ERK при обучении спустя 10 минут и 1 час не происходит (рис. 9).

Таким образом, недостаток активации MAPК/ERK в ЦНС, через нарушение экспрессии генов, необходимых для формирования долговременных механизмов пластичности, может определять неспособность ювенильных животных к выработке оборонительных рефлексов.

5. Анализ активации транскрипционного фактора Elk-1 при формировании условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии в париетовисцеральном ганглии Helix, у животных с нормальной и нарушенной способностью к обучению.

Как отмечалось выше, МАР-киназы осуществляют регуляцию экспрессии генов через фосфорилирование (активацию) ряда транскрипционных факторов, в том числе, связывающихся с регуляторным элементом SRE (Dash et al, 2005). Кроме того, при обучении взрослых Helix, происходит активация транскрипционных факторов, связывающихся с данным регуляторным элементом. У ювенильных животных с незрелыми механизмами формирования условных оборонительных рефлексов спектр ТФ, связывающихся с элементом SRE, отличен от взрослых, и активация не происходит (Гринкевич и др., 2002). Одним из ТФ, активирующим экспрессию генов через элемент SRE, является ТФ Elk-1. Поэтому представлялось актуальным провести сравнительные исследования активации транскрипционных факторов Elk-1 у животных с разной способностью к обучению (наивных животных; животных, которым вводили нейротоксин 5,7-диокситриптамина (5,7-ДОТ), а также у ювенильных животных). Для изучения экспрессии и активации факторов Elk-1 применяли метод Вестерн блот анализа с использованием антител к тотальным и фосфорилированным формам белка Elk-1. Исследование показало, что при обучении взрослых животных не наблюдается увеличение фосфорилирования Elk-1 по сравнению с контролем. Однако, у 5,7-ДОТ- обработанных и ювенильных животных, подвергнутых процедуре обучения, происходит значительное угнетение активации Elk-1 по сравнению с взрослыми обученными и наивными животными (Взрослые обученные: 0,76±0,19; наивные 1±0,12. Обученные 5,7-ДОТ-обработанные: 0,41±0,22; ювенильные: 0,06±0,26. Контроль принят за 1, p<0,05). При этом, у ювенильных животных, как и у 5,7-ДОТ-обработанных, базальный уровень синтеза и фосфорилирования белков Elk-1 достоверно не отличается. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что способность животных к формированию долговременных форм условных оборонительных рефлексов коррелирует с уровнем фосфорилирования ТФ Elk-1. Низкий уровень активации Elk-1 у 5,7-ДОТ-обработанных и ювенильных животных частично может быть связан с недостаточной активацией или дезактивацией MAPK/ERK каскада. Дезактивация MAPK/ERK-каскада у этих животных описана нами в предыдущих разделах. Кроме того, в дезактивации p-Elk возможно участие фосфатаз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В современной нейробиологии большое внимание уделяется изучению механизмов пластичности, лежащих в основе формирования долговременных механизмов обучения и памяти. В последние годы широко исследуется роль внутриклеточных регуляторных каскадов и нижележащих транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов, продукты которых непосредственно вовлекаются в пластические перестройки. Таким образом, комплексные исследования регуляции активации MAPK/ERK каскада, проведенные на простой нервной системе моллюска Helix являются актуальными.

Полученные нами данные о значительной и избирательной индукции MAPK/ERK в отдельных областях ЦНС и отдельных идентифицированных нейронах Helix, свидетельствуют о важной роли MAPK/ERK каскада в механизмах пластичности. Подтверждением специфичности связи активации MAP-киназы ERK с обучением являются наши данные об отсутствии активации MAPK/ERK каскада у животных с дисфункцией серотонинэргических терминалей (введение нейротоксина 5,7-ДОТ), неспособных к формированию оборонительных рефлексов, у животных, которым вводили ингибитор MAP-киназ ERK PD 98095, а также ювенильных животных. Кроме того, результаты введения 5,7-ДОТ позволяют сделать вывод о важной роли серотонина в индукции активации MAPK/ERK каскада. Этот вывод также подтверждают наши данные по отсутствию активации MAP-киназы ERK у ювенильных животных, подвергнутых обучению, так как в настоящее время неспособность ювенильных животных к формированию ассоциативных и неассоциативных форм оборонительных рефлексов связывают с незрелостью серотонинэргической системы. Однако остается неизвестным, с пресинаптическим, или постсинаптическим звеном трансдукции серотонинового сигнала связаны эти явления. Дальнейшие сравнительные исследования состава и содержания серотониновых рецепторов в ЦНС взрослых и ювенильных животных, начатые нами, представляются перспективными.

Известно, что мишенями MAPK/ERK являются транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов через регуляторные элементы SRE, CRE и нижележащие транскрипционные факторы семейства AP-1, и активация этих факторов происходит при обучении Helix (Гринкевич, 2001). Таким образом, низкий уровень активации MAPK/ERK у 5,7-ДОТ-обработанных и ювенильных животных, через нарушение экспрессии нижележащих генов может лежать в основе неспособности животных к формированию долговременных форм оборонительных рефлексов.

ВЫВОДЫ

  1. В ЦНС виноградной улитки экспрессируется МАР-киназа ERK2 с ММ 42 кДА. При выработке условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии наблюдается активация МАРK/ERK каскада. Разные сроки формирования данного рефлекса характеризуются разным уровнем активации МАР-киназ ERK. Причем, в ганглиях (париетовисцеральном, церебральном и педальном), играющих разную роль в формировании этого рефлекса, степень активации МАРK/ERK каскада различна.
  2. Значительные различия в активации МАРK/ERK каскада при обучении наблюдаются также в функционально-отличных идентифицированных нейронах Helix. Максимальная активация MAPK/ERK наблюдается в нейронах процеребрума, анализирующих информацию о запахах (условный стимул), и командных нейронах оборонительного поведения ППа(2/3) (основное пластическое звено данного рефлекса). При этом инкубация ЦНС с модуляторным медиатором серотонином вызывает однонаправленную с обучением активацию МАРK/ERK в исследуемых нейронах Helix.
  3. Введение нейротоксина 5,7-ДОТ, вызывающего дисфункцию серотониновых терминалей и редуцирующего способность к данной форме обучения, приводит к значительному снижению активации МАР-киназ ERK на ранних стадиях обучения, что свидетельствует о важной роли серотонина в индукции этого каскада.
  4. Активация МАРK/ERK каскада спустя 4 часа после обучения наблюдается во всех ганглиях, как у нативных, так и у 5,7-ДОТ-обработанных животных, что, вероятно, связано с включением неспецифических адаптивных процессов в ответ на сенситизирующий безусловный стимул.
  5. У ювенильных животных с незрелыми механизмами условных оборонительных рефлексов отмечается драматично низкий уровень фосфорилирования и соответственно активации МАРK/ERK по сравнению с взрослыми, в то время как уровень экспрессии этих киназ сравним. В отличие от взрослых животных обучение не индуцирует МАРK/ERK каскад в ЦНС ювенильных улиток спустя 10 мин и 1 час после процедуры обучения.
  6. Серотонин-индуцируемый MAPK/ERK каскад играет существенную роль в формировании условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии у моллюска Helix lucorum.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

  1. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Гудзик К.А., Гринкевич В.В., Харченко О.А. Сравнительный анализ активации транскрипционного фактора семейств ELK-1 в ЦНС животных, обладающих разной способностью к обучению. // Доклады Академии Наук. 2004.-Т. 397, №2.- С. 275-278.
  2. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Баранова К.А., Харченко О.А. Сравнительный анализ активации МАР/ERK в ЦНС животных, обладающих разной способностью к обучению. // Российский физиологический журнал им. Сеченова, 2006.- T.92, №5.- С. 536-545. [Переведено. Comparative analysis of the activation of MAP/ERK kinases in the CNS of animals with different learning abilities. Neurosci Behav Physiol. 2007.- 37(7).-P.715-20]
  3. Grinkevich L.N., Lisachev P.D., Kharchenko O.A., Vasil'ev G.V., Expression of MAP/ERK kinase cascade corresponds to the ability to develop food aversion in terrestrial snail at different stages of ontogenesis, Brain Res. 2008.- №1187.-P.12-19.

Тезисы:

  1. Гринкевич Л.Н, Лисачев П.Д., Васильев Г.В., Гудзик К.А., Харченко О.А. Регуляция экспрессии генов в нейронах центральной нервной системы HELIX при обучении. // Тез. докл. III съезда ВОГиС. Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития. Москва, 2004.- С. 381.
  2. Харченко О.А., Баранова К.А. Дисфункция серотониновых терминалей нейронов ЦНС взрослых улиток нарушает способность к формированию условных оборонительных рефлексов через ингибирование МАР/ERK киназного регуляторного каскада. // Тез. докл. всероссийской конференции молодых исследователей, «Физиология и медицина». Вестник молодых ученых. 2005.- С. 130.
  3. Харченко О.А., Лисачев П.Д., Баранова К.А., Гринкевич Л.Н. Роль серотонина в формировании условного оборонительного рефлекса у Helix (молекулярно-генетические аспекты). // Тез. докл. I Съезда физиологов СНГ. Сочи, Дагомыс. 2005.- С. 46-47.
  4. Харченко О.А., Баранова К.А., Лисачев П.Д, Гринкевич Л.Н. Серотонин-индуцированная активация МАР/ERK киназного регуляторного каскада лежит в основе формированию условных оборонительных рефлексов пищевой аверзии у HЕLIX. // Тез. докл. международного симпозиума «Механизмы адаптивного поведения». СПб, 2005.- С. 97-98.
  5. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Баранова К.А., Харченко О.А. Роль МАР/ERK киназного каскада в регуляции экспрессии генов при обучении (онтогенетические аспекты). // Тезисы международного симпозиума «Механизмы адаптивного поведения». СПб, 2005.- С. 26-27.
  6. Харченко О.А., Баранова К.А. Ключевая роль серотонина в индукции MAP/ERK киназного каскада и способности к обучению у Helix. // Тез. докл. X Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2006.- С. 171.
  7. Харченко О.А., Воробьева О.В. Серотонин индуцирует митоген-активируемый (MAP/ERK) киназный каскад в командных нейронах оборонительного поведения у Helix. // Тез. докл. 10-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». СПб, 2007.- С. 485-486.
  8. Гринкевич Л.Н., Харченко О.А., Лисачев П.Д. Роль митоген-активируемых каскадов в формировании механизмов пластичности. // Тез. докл. ХХ Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 2007. С. 31.
  9. Харченко О.А., Гринкевич Л.Н. Формирование условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии у Helix (роль серотонина). // Тез. докл. конференции молодых ученых, «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды».СПб, 2007.-С.79.
  10. Гринкевич Л.Н., Харченко О.А., Лисачев П.Д. Внутриклеточная сигнализация в механизмах формирования долговременной памяти. // Тез. докл. II Съезда Общества клеточной биологии. СПб, 2007. С. 735.
  11. Харченко О.А., Воробьева О.В., Гринкевич Л.Н. Формирование условного рефлекса пищевой аверзии сопровождается разной степенью активации MAP/ERK-киназного каскада в идентифицированных нейронах HELIX. // Тез. докл. конференции «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов», посвященной 100-летию со дня рождения М. Е. Лобашева. СПб, 2007.- С.
    Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»